广西巴马小型猪氟烷基因PCR-RFLP分析

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摘要：采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析了广西巴马小型猪的氟烷基因类型。结果显示，ＰＣＲ扩增获得广西巴马小型猪氟烷基因片段长４５２ ｂｐ，其碱基序列与ＧｅｎＢａｎｋ公布的普通猪同源性为９９．６％；采用ＨｈａⅠ酶切检测广西巴马小型猪、巴长二元杂猪和长白猪氟烷基因的ＰＣＲ产物，均产生２条电泳条带，未表现多态性；测序表明广西巴马小型猪氟烷基因第１ ８４３位碱基均为Ｃ。猪氟烷基因ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析技术为优质猪的培育提供了理论依据。

关键词：广西巴马小型猪；氟烷基因；ＰＣＲ－ＲＦＬＰ

中图分类号：Ｓ８２８．８＋９ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）18－4144-03

Analysis on Halothane Gene in Guangxi Bama Mini-pig with pcr-rflp

ＹＡＮ Ｘｕｅ－ｙｕ１，ＨＵＡＮＧ Ｙｕn１，ＹＡＮ Ｘｉａｏ－ｄｏｎｇ２，ＪＩＡＮＧ Ｑｉｎｇ－ｙａｎｇ１，ＧＵＯ Ｙａ－ｆｅｎ１，ＪＩＡＮＧ Ｈｅ－ｓｈｅｎｇ１

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００４，Ｃｈｉｎａ；

２．Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｆａｎｇｃｈｅｎｇｇａｎｇ， Ｆａｎｇｃｈｅｎｇｇａｎｇ ５３８０２１，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ hａｌｏｔｈａｎｅ（Ｈａｌ） ｇｅｎｅ ｉｎ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｂａｍａ ｍｉｎｉ－ｐｉｇ was ａｎａｌｙｓｉｚｅｄ ｂｙ ＰＣＲ－ＲＦＬＰ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｍｉｎｉ－ｐｉｇ Ｈａｌ ｇｅｎｅ ｗａｓ ４５２ ｂｐ， ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ９９．６％ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ． Ｔｗｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｗｈｅｎ ｔｈｅｓｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｈａｌ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｂａｍａ ｍｉｎｉ－ｐｉｇｓ， Ｂａｍａ ｍｉｎｉ－ｐｉｇ×Ｌａｎｄｒａｃｅ ｃｒｏｓｓｂｒｅｄｓ ａｎｄ Ｌａｎｄｒａｃｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＨｈａⅠ without ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ． Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ １８４３ｒｄ ｂａｓｅ ｏｆ ａｌｌ ｔｈｅ ｍｉｎｉ－ｐｉｇ Ｈａｌ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ Ｃ． ＰＣＲ－ＲＦＬＰ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ Ｈａｌ ｇｅｎｅ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ｐｉｇ ｂｒｅｅｄｉｎｇ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｇｕａｎｇｘｉ Ｂａｍａ ｍｉｎｉ－ｐｉｇ； hａｌｏｔｈａｎｅ ｇｅｎｅ； ＰＣＲ－ＲＦＬＰ

猪应激综合征（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｓｔｒｅｓｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＳＳ）易导致猪应激而突然死亡或产生白肌肉，给养猪业造成巨大的经济损失。ＰＳＳ是由于氟烷基因（Ｈａｌｏｔｈａｎｅ，Ｈａｌ）或称骨骼肌兰尼定受体基因（Ｒｙａｎｏｄｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇｅｎｅ，ＲＹＲ１）突变所致，兰尼定受体基因ＣＤＳ序列的Ｃ１８４３Ｔ１８４３突变致使受体蛋白的第６１５位的氨基酸发生变异（ＡｒｇＣｙｓ），引起蛋白结构和功能的改变；这种改变使猪在应激状态下肌肉组织中大量的Ｃａ２＋异常释放，引起血浆β－内啡呔过量分泌，电解质代谢出现紊乱，发生肌肉持续收缩，进而使猪产生恶性高热；肌肉组织收缩需要大量能量，氧化分解供能不足，需要依靠糖酵解来获得能量，致使乳酸产生过多，肌肉ｐＨ异常降低，出现ＰＳＥ肉［１］。内切酶ＨｈａⅠ能识别野生型ＨａｌＮ基因的５’－ＧＣＧＣ－３’，即Ｃ１８４３位点，因此，可利用内切酶ＨｈａⅠ检测Ｃ１８４３Ｔ１８４３突变位点来判断猪的应激敏感性。

不同猪种携带Ｈａｌｎ基因的频率不一样。文献报道我国地方猪种Ｈａｌｎ基因的频率为：二花脸猪０．５７％［２］、１０％～１６．６７％［２-４］，而内江猪、版纳猪、五指山小耳猪、藏猪均为０［５］。广西巴马小型猪或称巴马香猪尚未见此类文献报道。巴马香猪主产于广西区巴马瑶族自治县，其以体型矮小，皮薄肉细，肉质鲜美而闻名于世。本试验研究建立氟烷基因ＰＣＲ－ＲＦＬＰ突变检测技术，为广西巴马小型猪的选育和资源合理开发利用提供科学依据。

１ 材料与方法

１．１ 试验动物

广西巴马小型猪来源于广西大学巴马小型猪原种场。长白猪和巴长二元杂猪来源于广西大学动物科学技术学院实习基地猪场。

１．２ 试验方法

１．２．１ 引物的设计与合成 针对Ｈａｌ （ＲＹＲ１）基因内含子１６后端序列、外显子１７全部序列、内含子１７前端序列设计引物，其中Ｈａｌ基因 ＣＤＳ序列第１ ８４３位突变检测位点对应外显子１７的第１８ ６１８位点。引物序列为Ｐｒｉｍｅｒ（ｕｐ）：５′－ＧＡＧＴＧＧＡＧＴＣＴＣ

ＴＧＡＧＴＣＧＧ－３′；Ｐｒｉｍｅｒ（ｄｏｗｎ）：５′－ＣＣＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ

ＧＣＴＧＡＴＧ－３′。

１．２．２ 基因组ＤＮＡ的提取 猪血液总ＤＮＡ提取按照基因组ＤＮＡ提取试剂盒操作。

１．２．３ ＰＣＲ反应 ＰＣＲ反应体系：１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，ＭｇＣｌ２ １．５ μＬ，ｄＮＴＰｓ ２．０ μＬ，Ｐｒｉｍｅｒｓ（ｕｐ，ｄｏｗｎ） ０．７ μＬ，Ｔａｑ酶 ０．３ μＬ，总ＤＮＡ模板５ μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ至２５ μＬ。