盐酸水解对Feulgen染色的作用
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[摘要] 目的 探讨盐酸水解在feulgen染色中的作用,在提高染色质量的同时寻求一种快速、简便的染色方法。方法选取口腔颌面部低分化鳞癌、高分化鳞癌各30例,分别用3种不同盐酸水解方法进行Feulgen染色,比较3种水解方法的染色效果,并进行肿瘤细胞DNA含量分析。结果与结论 热酸解时DNA酸解时间非常短暂,要控制醛基最大量很困难。室温下盐酸水解(冷酸解)细胞核染色深,结构清晰。细胞核DNA异倍体含量的测量能清楚地反映口腔鳞癌细胞的恶变程度。冷酸解情况下,醛基释放时间则大大延长,且步骤简化易行,一步水解代替了传统三步法,不必精确控制盐酸水解温度及时间,且所获得效果满意,是较为适合的水解方法。
[关键词] 口腔颌面部鳞癌;Feulgen染色;盐酸水解
[中图分类号] O611.63 [文献标识码] B [文章编号] 1671-7562(2009)05-0342-03
细胞DNA含量反映细胞生长及分化状态,对其含量的测定在判定肿瘤性质及预后方面具有重要意义。Feulgen染色由于在显示细胞核DNA含量时较精确,具有一定特异性而被广泛应用,该法与图像分析相结合应用于临床病理,在肿瘤诊断及预后判断方面已成为重要辅助手段。目前临床常用酸解方法有两种,即1 mol•L-1 HCL 60 ℃热酸解法和高浓度盐酸室温冷酸解法。因盐酸水解时间和温度对染色效果影响很大,探讨盐酸水解作用就显得尤为重要。热酸解法时DNA酸解高峰期和平台期时间非常短暂,要控制醛基最大量很困难,染色也较难控制。文献报道,常温条件下,DNA磷酸脂键对酸解敏感性较低,酸解时间延长至12 h时DNA链的断裂程度仍比较轻微,酸解18 h以上DNA链的断裂才比较显著。而冷酸解情况下,高峰期和平台期时间则大大延长,对最大量暴露醛基较为有利,而且不必精确控制盐酸水解温度及时间。多数作者推荐使用室温冷酸解法。我们选用目前临床常用的3种不同染色方法进行比较,旨在提高染色质量[1-2]的同时寻求一种快速、简便的染色方法。
1 材料与方法
1.1 材料
取自第四军医大学口腔医院病理科肿瘤手术切除标本,口腔颌面部低分化鳞癌、高分化鳞癌各30例,年龄40~60岁,男女不限。诊断结果均由3位教授会诊得出,常规4%甲醛固定,脱水、石蜡包埋,切片厚5 μm。每份标本均切片3张,Schiff液选择传统热配法。电热恒温水浴锅为北京科伟HH-1型。
1.2 染色方法
按染色方法不同分为3组。A组采用临床常规染色方法,B组和C组采用两种临床较为认可的改良及快速染色方法[3]。切片均脱蜡至水,A组常规1 mol•L-1 HCl室温浸1 min,60 ℃预热的1 mol•L-1 HCl浸8 min,水解后再次1 mol•L-1 HCl室温浸1 min。蒸馏水洗后入Schiff液中置37 ℃恒温箱40 min,亚硫酸钠洗液洗3遍后常规脱水、透明、封片。B组切片室温下6 mol•L-1 HCl水解15 min,水解后流水冲洗2 min,蒸馏水洗后浸入新配制Schiff液中,37 ℃染30 min,亚硫酸钠洗液洗3遍后常规脱水、透明、封片。C组切片用提前60 ℃预热的3 mol•L-1HCl水解6 min,蒸馏水冲洗2 min后浸入Schiff液,37 ℃恒温箱45 min,亚硫酸钠洗液浸洗3遍,每次5 min,流水冲洗5 min后脱水、透明、封片。
1.3 统计学处理
染色后按常规方法进行各组染色效果比较及肿瘤细胞DNA含量分析。采用HMIAS-2000彩色医学图文分析系统采集图像,多点测量染色阳性的细胞染色灰度值,累计取均数。SPSS11.0软件行方差分析。
2 结果
2.1 染色时间
3种不同水解方法染色时间比较:用60 ℃预热3 mol•L-1 HCl水解法(C组)染色时间约1.4 h;常规1 mol•L-1 60 ℃预热法(A组)约需1.5 h;用室温6 mol•L-1 HCl水解法(B组)在程序上相对简单易行,且时间也缩短,耗时1 h。
2.2 染色结果2.2.1 镜下表现 C组水解法显示细胞核染色淡,结构较清晰(图1)。常规A组60 ℃预热法及B组水解法细胞核染色深,结构清晰(图2)。
2.2.2 DNA含量分析结果 C组DNA倍体分析显示DNA含量低于A、B组(P0.05)。且各组间低分化鳞癌较之高分化鳞癌细胞的DNA分裂增殖能力有显著提高(P
3 讨论
Feulgen染色是一种特殊的细胞化学反应,盐酸水解是影响染色的关键。DNA酸解过程就是醛基暴露过程,主要是通过酸水解使DNA中嘌呤-脱氧核糖键打开,暴露出醛反应基,然后通过Feulgen液显色。其暴露量和酸解程度关系密切,过度酸解会使DNA链断裂。研究显示DNA酸解过程约分4期来完成:Ⅰ期为上升期,此期醛基数量随水解时间延长而不断增加;Ⅱ期为高峰期,此期醛基数量达高峰;Ⅲ期为平台期,此期由酸解产生的醛基数量与酸解导致DNA断裂流失到胞质中醛基减少的数量相对保持平衡,醛基数量维持在一个比较高的动态水平;Ⅳ期为消退期,随着水解时间的延长DNA断裂增加,醛基流失速度大于醛基产生速度,醛基数量逐渐减少。我们只有设法延长Ⅱ、Ⅲ期时间,使其相对最大化,才能最大量暴露醛基使其与Schiff染液反应。水解时间和温度稍有偏差,直接影响DNA含量检测结果。目前临床常规用60 ℃预热1 mol•L-1 HCl进行水解,虽能获得满意效果,细胞核染色深,结构清晰,但水解步骤较为繁杂。3 mol•L-1 HCl 60 ℃水解法显示细胞核染色淡,结构较清晰,可能是酸解过度DNA链断裂后醛基数量逐渐减少所致。目前推荐使用本实验中试用的室温冷酸解法即B组方法。室温下6 mol•L-1盐酸水解步骤简化,一步水解代替了传统三步法,不必精确控制盐酸水解温度及时间,且所获得效果满意,细胞核染色深,结构清晰。这可能与冷酸解情况下,上述Ⅱ、Ⅲ期时间相对延长,醛基能够最大量暴露,与Schiff染液反应充分有关。直接影响Feulgen染色结果的因素很多,主要包括固定液的种类、酸解液浓度、酸解时间和温度控制等。固定液可使DNA分子空间结构改变,对酸解敏感性有影响,应用不当甚至可能破坏DNA结构,使之无法酸解。临床常用福尔马林液固定对DNA结构影响适中,水解时间相对较短,较适合进行染色。Schiff液染色时必须保证染液新鲜,染料过期会出现粉红色背景着色,胞核着色不清晰,外界温度对其影响不大。据笔者经验,新鲜配制的Schiff液应置于棕色瓶内4 ℃保存,颜色变红则不能使用。染色时加热可加快反应,有利于细胞着色,染色时置于37℃恒温箱较为合适。采用室温下6 mol•L-1 HCl水解法进行Feulgen染色,通过对细胞核DNA异倍体含量的测量显示该水解染色方法能清楚地反映口腔鳞癌细胞的恶变程度,对评价治疗和预后具有重要指导意义[4-5]。
[参考文献]
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[收稿日期] 2009-03-11