艾烟中可吸入颗粒诱发染色体畸变效应的实验研究

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摘要：目的 采用染色体畸变实验检测艾烟中可吸入颗粒物是否影响细胞DNA结构或改变信息的实现，进而判定艾烟的遗传毒性。方法 通过四氮唑盐比色实验得出艾烟冷凝液（MSC）对中国仓鼠卵巢细胞染毒24 h的半数抑制率IC50为0.087 mg/mL，体外培养哺乳动物中国仓鼠卵巢细胞系（CHO），体外代谢活化（S9）及非活化的情况下染毒细胞24 h，随机分为空白组、丝裂霉素C组、1/2 IC50MSC组、1/4 IC50MSC组、1/8 IC50MSC组、空白+S9组、环磷酰胺+S9组、1/2 IC50MSC+S9组、1/4 IC50MSC+S9组、1/8 IC50MSC+S9组。秋水仙胺作用于中期染色体收获细胞，制备染色体标本，观察细胞染色体畸变情况，并进行分析。结果 MSC畸变细胞率和染色体总畸变率由高到低依次为环磷酰胺+S9组>MSC+S9组≥丝裂霉素C组>空白+S9组>MSC组≥空白组。结论 艾烟具有生物活性，高浓度的艾烟表现出一定的细胞毒性。

关键词：艾烟；可吸入颗粒物；中国仓鼠卵巢细胞；染色体畸变

中图分类号：R245.8 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）01-0034-03

气动力学当量直径在10 ?m以下的颗粒物，是从事环境科学工作者所注目的研究对象之一，目前空气质量[4]和环境污染[5-7]多用PML0代表空气污染物。故本实验以艾烟中的PML0为研究对象，用四氮唑盐（MTT）实验得出艾烟染毒液对中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）细胞的半数抑制率，后进行染色体畸变实验[8-13]，为艾烟安全评价提供一定数据，现报道如下。

1 实验材料

市售南阳汉医有限责任公司生产的3年陈艾灸条10支，规格18 mm×200 mm。便携式PM2.5＼PML0采样器。剑桥滤片规格F319-04 Whatman International Ltd提供。CHO细胞，中国人民军事医学科学院二所四室提供；二甲基亚砜（DMSO）、培养基DMEM（高糖），美国Gibco公司。丝裂霉素C （MMC）、环磷酰胺（CP）、秋水仙胺为美国Sigma公司；大鼠代谢活化系统（S9）混合物和Giemsa染料（自制）。

2 方法与结果

2.1 艾烟中可吸入颗粒物的制备

剑桥滤片常温干燥24 h后用便携式PM2.5＼PML0采样器PML0采样头采艾烟，干燥24 h后称质量，DMSO溶解剑桥滤片得艾烟冷凝液（moxibustion smoke condensation，MSC），过滤除菌后分装-80 ℃冰箱保存待用。

2.2 四氮唑盐比色实验

取指数生长期CHO细胞，0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×105/mL，每孔以100 ?L细胞悬液接种于96孔培养孔板内，每个剂量设8个平行孔，然后以终浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.18 mg/mL的MSC培养液（各培养液DMSO浓度相同，均为5‰）对细胞染毒，终体积200 ?L，各孔保持一致，置于37 ℃、5%CO2和95%相对湿度条件下孵箱内培养24 h，取出96孔板，超净工作台无菌条件下每孔加入MTT溶液20 ?L，继续孵育培养4 h，取出后，弃去上清液，每孔加入150 ?L DMSO摇床振荡10 min，使结晶体充分溶解。用自动酶标分析仪在570 nm波长处测定各孔光吸收值（A570），计算各染毒浓度的细胞存活率。细胞抑制率（%）=（1-染毒组A570/未染毒组A570）×100%，利用SPSS18.0得出半数抑制率IC50为0.087 mg/mL，实验重复3次，结果稳定，细胞抑制率随浓度变化（见图1）。后期以0.087 mg/m3（显示最大毒性的数据），作为IC50值染色体畸变实验。

2.3 染色体畸变实验

实验选用CHO细胞，在细胞进入指数生长期后，染毒24 h，加入秋水仙胺，终浓度为0.15 ?g/mL，继续培养12 h收获细胞。吹打细胞使其脱落后将细胞移至离心管，1 000 r/min离心10 min，吸弃上清液，0.075 mol/L氯化钾低渗20 min，甲醇-冰醋酸3∶1的固定液2次，气干法滴片，Giemsa染色。实验设空白组、MMC组、1/2 IC50MSC组、1/4 IC50MSC组、1/8 IC50MSC组、空白+S9组、CP+S9组、1/2 IC50MSC+S9组、1/4 IC50 MSC+S9组、1/8 IC50MSC+S9组。结果初检：在低倍镜和高倍镜下初步观察细胞和染色体色泽、分裂相数量、染色体分散度等情况良好时，调至油镜下直接分析和计数100个中期分裂相/样本。CHO染色体畸变粗分为5类，即染色体易位、环状染色体、断片、断裂、裂隙以及多倍体。染色体单体裂隙单独记录，不列入畸变内。结果判定标准：畸变细胞率50%，阳性（+++）。

畸变类型包括数目畸变和结构畸变，结构畸变包括染色单体型畸变和染色体型畸变二类。单体型畸变有：单体裂隙、双间隙、单体断裂、单体互换和单体缺失；染色体型畸变有：双着丝粒体、环和无着丝粒断片。单体类型畸变中以单体裂隙、单体断裂和单体互换为多见，染色体型畸变以无着丝粒断片多见。染色体畸变细胞数和总畸变率一致，由高到低依次为CP+S9组>MSC+S9组≥MMC组>空白+S9组>MSC组≥空白组，见表1、图2～图4。

3 讨论

采用细胞遗传学的方法检测药物的遗传毒性是比较成熟和可靠的方法之一，以细胞株的单层细胞培养物进行遗传学分析；CHO具有世代时间短、核型稳定、染色体数目少等优点。考虑到生殖系统对毒物的作用十分敏感，在其他系统还未出现毒性反应之前，生殖系统可能已出现损害。因此，本实验选用CHO细胞。首先通过细胞的毒性实验得出MSC对CHO的半数致死浓度，提示高浓度的MSC对CHO具有杀伤力，有细胞毒性，从另一个侧面反映了艾烟的生物活性。本研究中染色体畸变实验提示MSC具有潜在的遗传毒性，尚未发现剂量效应关系。遗传毒性须考虑体内和体外的差异以及艾烟剂量的累计等方面。查阅文献，艾烟中的PML0成分未见报道，但靳氏等[14]检出艾中含桉叶油醇、棕榈酸、刺柏脑、石竹烯、龙脑、樟脑、侧柏酮等成分，其中侧柏酮[15]是一种神经毒素，能引起神经痉挛。本实验中MSC浓度为0.04 mg/mL，侧柏酮的浓度尚未测定，是否达到毒性标准，并导致MSC毒性应进行进一步实验。另外，该毒性是否由艾烟中的可吸入颗粒直接对细胞造成的机械性损伤导致也未曾得到验证。本实验为将可吸入颗粒物尽可能全部溶解，选用DMSO，整个实验过程中DMSO浓度一致，排除DMSO致畸变效应。本实验结果中MSC无代谢活化的情况下反降低了畸变率，说明艾烟本身增强了CHO细胞对染色体畸变的抵抗。

综上所述，MSC中具有生物活性物质，高浓度的艾烟可能有潜在遗传毒性的物质。但是因实验中MSC用量0.04 mg/mL，较平阳霉素0.1 ?g/mL[16]大（400倍），造成了毒性物质的蓄积，用量远远大于临床，或者说夸大了MSC的毒性。我们应当对MSC建立一个安全评价体系，并对其进行生物活性实验，寻找艾烟中的具有生物活性物质。

参考文献：

[1] 许焕芳，崔莹雪，黄茶熙，等.艾燃烧生成物对快速老化模型小鼠SAMP8血清抗氧化酶的影响[J].中国针灸，2012，32（01）：53-57.

[2] 崔莹雪，赵百孝.艾灸与芳香疗法[J].中华中医药杂志，2010，25（10）：1548-1551.

[3] 李春梅.艾灸烟雾的吸入对针灸师的影响[J].国外医学：中医中药分册，1994，16（8）：57-58.

[4] 国家质量监督检验检疫总局，卫生部，国家环境保护总局. GB/T18883-2002室内空气质量标准[S].北京：中国标准出版社，2003.

[5] Vidotto JP， Pereira L， Braga A， et al. Atmospheric pollution：Influence on hospital admissions in paediatric rheumatic diseases[J]. Lupus，2012，21（5）：526-533.

[6] Mallone S， Stafoggia M， Faustini A， et al. Saharan dust and associations between particulate matter and daily mortality in Rome， Italy[J]. Environmental Health Perspectives，2011，119（10）：1409-1414.

[7] Leitte AM， Schlink U， Herbarth O， et al. Size-segregated particle number concentrations and respiratory emergency room visits in Beijing， China[J]. Environmental Health Perspectives， 2011，119（4）：508-513.

[8] 黄念君.染色体畸变试验中CHL细胞系/剂量法则的应用.遗传，1984， 6（6）：26.

[9] 万旭英，马玺里，毕洁，等.连翘酯苷冻干粉的遗传毒性试验[J].毒理学杂志，2007，21（4）：318.

[10] 刘清，郭宝岚，李立，等.染发剂的体外染色体畸变实验[J].环境与健康杂志，2006，23（3）：233-234.

[11] 秦钰慧，郭润荣.使用CHO细胞染色体畸变和SCE检测致癌物[J].卫生研究，1984，13（6）：14-18.

[12] 冯嘉林，邵松生，林雅萍，等.低剂量60Coγ线诱发人血淋巴细胞早熟凝聚染色体畸变的剂量效应曲线研究[J].辐射研究与辐射工艺学报， 1990，8（2）：107-110.

[13] 马华智，廖明阳，王治乔.三-（2-甲基-1-氮丙啶）磷化氧对中国仓鼠卵巢细胞的体外诱变性[J].中国药理学与毒理学杂志，1993，7（2）：104-107.

[14] 靳然，于密密，赵百孝，等.不同年份蕲艾叶及不同比例艾绒化学成分研究[J].中国针灸，2010，30（5）：389-392.

[15] 吴婷，金其璋.不同食品中侧柏酮、龙蒿脑、黄樟素和甲基丁香酚的含量测定[J].中国食品添加剂，2010（1）：223-228.

[16] 沈光平，王钦南，周祉祯.平阳霉素三种成份诱发染色体畸变的研究[J].遗传学报，1984，11（2）：109-112.

（收稿日期：2012-07-05，编辑：华强）