人参皂苷CK的抗炎及神经保护作用研究

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[摘要] 目的 观察人参皂苷ck的抗炎及神经保护作用并探讨其作用机制。 方法 ①复制脂多糖（LPS）诱导小鼠败血症模型，观察人参皂苷CK对脑内小胶质细胞变化及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的影响；②复制大鼠脑缺血再灌注损伤模型，观察人参皂苷CK对脑梗死灶体积百分比和小胶质细胞变化的影响；③原代培养小胶质细胞，观察人参皂苷CK对LPS诱导的细胞激活及培养液中一氧化氮（NO）含量和细胞内活性氧（ROS）含量变化的影响。 结果 ①模型对照组脑内TNF-α [（198.38±12.84）mg/L]和IL-1β [（845.15±41.97）ng/L]含量明显高于正常对照组[（106.71±11.21）mg/L、（477.46±49.76）ng/L]，阳性对照组[（141.46±11.91）mg/L、（690.94±54.71）ng/L]和人参皂苷CK低[（157.23±12.25）mg/L、（726.04±64.29）ng/L]、中[（136.58±13.17）mg/L、（651.88±55.65）ng/L]、高[（121.33±12.09）mg/L、（577.36±51.86）ng/L]剂量组，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。②人参皂苷CK低[（30±7）个/500 μm2]、中[（20±5）个/500 μm2]、高[（13±4）个/500 μm2]剂量组中大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤凝集素阳性细胞数均低于模型组[（46±11）个/500 μm2]，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；与模型组比较，人参皂苷CK低、中、高剂量组能明显减少脑梗死灶体积的百分比，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。③人参皂苷CK低[（18.16±0.59）mol/L]、中[（12.43±0.52）mol/L]、高[（6.17±0.34）mol/L]剂量组细胞培养液中的NO浓度均低于LPS组[（23.19±0.45）mol/L]，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；人参皂苷CK低[（1.78±0.14）mol/L]、中[（1.56±0.23）mol/L]、高[（1.13±0.09）mol/L]剂量组细胞内ROS浓度均低于LPS组[（2.57±0.13）mol/L]，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 人参皂苷CK具有抗炎和神经保护作用，有希望成为防治脑缺血和其他神经炎症疾病的药物；抑制小胶质细胞激活可能是其作用机制。

[关键词] 人参皂苷CK；小胶质细胞；败血症；脑缺血

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（c）-0013-05

小胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫细胞，存在静息和激活两种状态，在脑缺血损伤、炎症反应、神经退行性疾病发生时易被激活并分泌多种炎症因子，如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1，IL-1β）和活性氧（reactive oxygen species，ROS），一氧化氮（nitric oxide，NO）等细胞毒性物质[1-2]。因此，抑制小胶质细胞激活的药物对治疗神经系统病变具有重要意义。人参皂苷CK[20-O-β-D-葡萄糖基-20（S）-原人参二醇，compound K，CK]是原人参二醇型人参皂苷Rb1、Rb2和Rc等在人体内主要吸收形式和药效实体，具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、抗糖尿病、抗过敏等，并可通过多种途径发挥抗炎作用[3-5]。同时，原人参二醇型人参皂苷的神经保护作用也得到了充分认识[6-7]。本课题旨在观察人参皂苷CK的抗炎及神经保护作用并探讨其作用机制，为其成为治疗神经系统病变的药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

ICR小鼠120只（雄性，SPF级，18～22 g）；SD大鼠70只（雄性，4～5个月，SPF级，180～220 g）；新生SD大鼠1只（2 d）由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，所有动物实验均符合广东省和深圳市龙岗中心医院关于实验动物福利和伦理学的要求。

1.2 试剂

人参皂苷CK（四川维克奇生物科技有限公司，HPLC≥98%）；过氧化物酶标记的链霉卵白素-亲和素SP试剂盒（北京中山生物技术公司）；小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（上海易利生化试剂有限公司）；小鼠白细胞介素1β（IL-1β）ELISA试剂盒（上海沪峰化工有限公司）；细胞内活性氧（ROS）红色荧光测定试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司）。脂多糖（LPS）、地塞米松、生物素标记的B4凝集素购自Sigma公司；DMEM/F12培养基、胎牛血清购自Gibco公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 人参皂苷CK对LPS诱导小鼠败血症的影响

1.3.1.1 分组、给药及造模 ICR小鼠120只，随机分为6组，即正常对照组、模型对照组、阳性对照组（地塞米松30 mg/kg）、人参皂苷CK低、中、高剂量组（10、20、40 mg/kg），每组20只。正常对照组和模型对照组给予生理盐水，阳性对照组给予地塞米松30 mg/kg，人参皂苷CK低、中、高剂量组分别给予人参皂苷CK 10、20、40 mg/kg，腹腔注射，0.1 mL/10 g，连续给药7 d，末次给药后30 min，除正常对照组外，其余各组均腹腔注射LPS 5 mg/kg（0.1 mL/10 g）。

1.3.1.2 指标测定 ①胶质细胞凝集素标记染色：注射LPS 3 h后，每组随机选取10只小鼠麻醉处死，取脑，快速脱水，低温石蜡包埋，冠状组织切片（厚度约30 μm，间隔600 μm），37℃恒温箱中脱蜡至水，加入含3% H2O2的甲醇室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min，加入生物素标记的B4凝集素（终浓度5 μg/mL）37℃孵育1 h，然后置于4℃冰箱孵育24 h（阴性对照用0.01 mol/L PBS替代凝集素），PBS冲洗2次，每次5 min，加入过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液37℃孵育30 min，PBS冲洗2次，每次5 min，自来水洗，苏木红复染1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。②TNF-α、IL-1β含量测定：注射LPS 6 h后将每组剩余的10只小鼠麻醉处死，取脑，组织匀浆，取上清液按试剂盒说明操作用ELISA法测定TNF-α、IL-1β的含量。

1.3.2 人参皂苷CK对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响

1.3.2.1 分组、给药及造模 SD大鼠70只，随机分为5组，即假手术组、模型组、人参皂苷CK低、中、高剂量组（10、20、40 mg/kg），每组14只。假手术组和模型组给予生理盐水，人参皂苷CK低、中、高剂量组分别给予人参皂苷CK 10、20、40 mg/kg，腹腔注射，0.2 mL/100 g，连续给药7 d，末次给药后30 min，参照Longa等[8]的方法，采用颈内动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。简述如下：大鼠麻醉后固定，分离并结扎颈总动脉近心端及颈外动脉根部，夹闭颈总动脉远心端，距分叉约10 mm处剪口插入头端膨大的尼龙鱼线约18 mm。假手术组仅分离颈总及颈外动脉，不插线。选择苏醒后行走向右旋转或右侧肢体瘫痪的大鼠为栓堵成功者进行实验。缺血3 h后行再灌注。

1.3.2.2 指标测定 各组动物在缺血再灌注72 h后处死，取脑，快速脱水，低温石蜡包埋，冠状组织切片（厚度约30 μm，间隔600 μm），分别做红四氮唑（TTC）染色和小胶质细胞凝集素标记染色。TTC染色：将切片置于TTC溶液中37℃孵育30 min，正常脑组织被染为红色，梗死灶呈白色，用病理图像分析系统（BN-TW-5001）分析，计算梗死灶体积值和缺血侧半球体积值并计算梗死体积百分比[9]。小胶质细胞凝集素标记染色方法同“1.3.1.2”项下。

1.3.3 人参皂苷CK对LPS激活原代培养小胶质细胞的影响

1.3.3.1 细胞培养 小胶质细胞原代培养参照Park等[10]方法进行，简述如下：新生SD大鼠1只（2 d）麻醉后处死，取脑，分离大脑皮层并消化，细胞悬液过滤后加入DMEM/F12完全培养基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）终止消化，反复吹打制成单细胞悬液，离心弃上清，DMEM/F12完全培养基重悬后静置30 min，取细胞悬液接种到多聚赖氨酸包被的培养瓶中，37℃，5%CO2培养箱中培养，3 h后换液，以后每2天换液1次，显微镜下观察到出现细胞分层现象后，吸弃培养液，加入无血清DMEM/F12培养液3∶1稀释的胰蛋白酶（25%）消化25～40 min，将含有悬浮的小胶质细胞的培养液转入另一培养瓶中培养24 h后更换DMEM/F12完全培养基继续培养，经鉴定小胶质细胞纯度> 95 %后开始实验。

1.3.3.2 指标测定 ①细胞形态观察：细胞接种于24孔培养板中（5×104个/孔），分为正常对照组、LPS组和人参皂苷CK低、中、高剂量组（20、40、80 mmol/L）。细胞培养16 h后加入人参皂苷CK（以DMEM/F12完全培养基配制，正常对照组和LPS组加入等体积培养基）培养24 h，再加入LPS（1 mg/L）继续培养24 h，40 g/L多聚甲醛固定10 min，凝集素标记染色（方法同“1.3.1.2”项下），倒置荧光显微镜下观察细胞形态。②培养液中一氧化氮（NO）含量测定：细胞接种于24孔培养板（3×106个/孔），培养16 h后，分组与药物处理方法同上。处理到预定时间后，吸取培养上清液100 μL加入96孔板，加入等体积Griess试剂（5%磷酸配制1%磺胺，蒸馏水配制0.1%盐酸萘乙二胺，临用前等体积混合）混匀，室温避光静置10 min，酶标仪测540 nm吸光度值，亚硝酸钠绘制标准曲线，计算样品中NO的量，平行测定3次，计算平均值。③细胞内ROS含量测定：细胞接种于6孔培养板（6×106个/孔），分组与药物处理方法同上，处理到预定时间后，严格按照ROS试剂盒说明书操作，采用流式细胞仪测定ROS相对含量（设正常对照组细胞内ROS含量为1），平行测定3次，计算平均值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人参皂苷CK对LPS诱导小鼠败血症的影响

凝集素标记染色显示，模型对照组凝集素标记阳性细胞数[（58±14）个/500 μm2]明显多于正常对照组[（10±3）个/500 μm2]，差异有高度统计学意义（P < 0.01），阳性细胞形态大小不一，多为圆形和椭圆形，少数有树枝状分枝，证明LPS可诱导小鼠脑内小胶质细胞激活。阳性对照组（地塞米松）[（31±9）个/500 μm2]和人参皂苷CK低[（38±8）个/500 μm2]、中[（22±5）个/500 μm2]、高[（16±4）个/500 μm2]剂量组凝集素阳性细胞数均少于模型对照组[（58±14）个/500 μm2]，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），证明人参皂苷CK可减少LPS诱导的败血症小鼠脑内小胶质细胞的激活。见表1。模型对照组脑内TNF-α [（198.38±12.84）mg/L]和IL-1β [（845.15±41.97）ng/L]含量明显高于正常对照组[（106.71±11.21）mg/L、（477.46±49.76）ng/L]、阳性对照组[（141.46±11.91）mg/L、（690.94±54.71）ng/L]和人参皂苷CK低[（157.23±12.25）mg/L、（726.04±64.29）ng/L]、中[（136.58±13.17）mg/L、（651.88±55.65）ng/L]、高[（121.33±12.09）mg/L、（577.36±51.86）ng/L]剂量组，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），证明人参皂苷CK可减少LPS诱导的TNF-α和IL-1β表达。见表2。

2.2 人参皂苷CK对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响

TTC染色显示，模型组脑片中有明显的不显色区域（白色），与周围正常脑组织界限清楚，假手术组脑组织红染，未见明显梗死灶。凝集素标记染色显示，模型组梗死灶边缘分布有大量凝集素标记阳性的细胞，模型组凝集素阳性细胞数[（46±11）个/500 μm2]明显高于假手术组[（11±3）个/500 μm2]，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；人参皂苷CK低[（30±7）个/500 μm2]、中[（20±5）个/500 μm2]、高[（13±4）个/500 μm2]剂量组凝集素阳性细胞数均低于模型组[（46±11）个/500 μm2]，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；与模型组比较，人参皂苷CK低、中、高剂量组能明显减少脑梗死灶体积的百分比，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），并能抑制小胶质细胞的激活。见图1、表3。

2.3 人参皂苷CK对LPS激活原代培养小胶质细胞的影响

凝集素标记染色显示LPS（1 mg/L）处理细胞24 h，原代培养的小胶质细胞形态发生变化，与正常对照组相比，细胞即呈激活状态：细胞形态变大，伸出突起，呈多角形，荧光亮度强；对照组细胞呈圆形，荧光强度弱。不同浓度人参皂苷CK （20、40、80 mmol/L）预保护24 h，对LPS诱导的激活形态有明显恢复作用，细胞基本恢复到与正常对照组相同。用LPS（1 mg/L）处理24 h，LPS组细胞培养液中的NO浓度[（23.19±0.45）mol/L]明显高于正常对照组[（0.67±0.22）mol/L]，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；不同浓度人参皂苷CK（20、40、80 mmol/L）预处理24 h，人参皂苷CK低[（18.16±0.59）mol/L]、中[（12.43±0.52）mol/L]、高[（6.17±0.34）mol/L]剂量组细胞培养液中的NO浓度均低于LPS组[（23.19±0.45）mol/L]，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），说明人参皂苷CK对LPS导致的胞外NO浓度有抑制作用。不同人参皂苷CK（20、40、80 mmol/L）预处理24 h，人参皂苷CK低[（1.78±0.14）mol/L]、中[（1.56±0.23）mol/L]、高[（1.13±0.09）mol/L]剂量组细胞内ROS浓度均低于LPS组[（2.57±0.13）mol/L]，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），对LPS导致的ROS表达阳性的细胞数的增加有显著抑制作用。结果表明人参皂苷CK可抑制LPS诱导的小胶质细胞激活并可抑制LPS诱导的NO含量和ROS含量增加。见图2、表4。

3 讨论

小胶质细胞是中枢神经系统中重要的免疫细胞，正常情况下处于静息状态，数量很少，当发生脑缺血、中风、炎症反应或神经退行性疾病时，小胶质细胞从静息状态向激活状态转变。在小胶质细胞发生激活时，形态上会发生改变，原代培养的小胶质细胞，由圆形或具有分枝的形态变大为阿米巴状[11]。在动物模型上亦可观察到类似的改变。小胶质细胞的标志物较多，其中，凝集素B4可标志激活的小胶质细胞，而静息状态的小胶质细胞对其呈阴性。因此，可采用凝集素B4标记阳性来作为小胶质细胞激活的判断标准之一。

败血症乃是一种常见的临床危重急症，病死率高达40%～70%，可发生全身性炎症反应[12]。LPS是常用于制作实验性败血症模型的物质之一，可诱导小胶质细胞的激活，并释放出TNF-α、IL-1β等许多细胞因子和炎症介质，导致细胞、组织、器官的损伤[13]。因此，抑制小胶质细胞的激活和细胞因子及炎症介质的释放，对败血症患者具有一定的保护作用。本课题采用LPS复制小鼠败血症模型，观察人参皂苷CK对其影响，结果表明，人参皂苷CK可有效抑制LPS诱导的小胶质细胞激活，并可显著降低脑内TNF-α、IL-1β的表达，证明人参皂苷CK在败血症治疗尤其是用于败血症患者炎症治疗中具有良好的开发前景。

在局灶性脑缺血再灌注损伤模型中，小胶质细胞亦可被激活，激活的小胶质细胞具有早期损伤和晚期保护双重作用。在缺血早期，小胶质细胞参与缺血性神经元的损害过程，适当抑制小胶质细胞的过度激活可减少细胞毒性作用和病理损害[14]。本课题通过复制大鼠MACO模型，观察人参皂苷CK的保护作用。结果表明，人参皂苷CK可显著减少MCAO致局灶脑缺血大鼠的脑缺血梗死灶体积，对脑缺血引起的小胶质细胞激活的抑制作用可能是其发挥神经保护作用的机制。

在体外实验中，原代培养的小胶质细胞可被LPS诱导激活，并释放出大量ROS，进而发生氧化应激而影响其炎症反应性[15]，如导致一些炎症相关的因子包括诱导型一氧化氮合酶（iNOS）转录水平的改变，促进合成NO，发挥杀伤肿瘤细胞及抵抗细菌、真菌及寄生虫等感染的作用[16-17]。但iNOS过表达又会引起大量的和长时间的NO释放，是造成神经细胞损伤的重要原因[18]。人参皂苷CK为原人参二醇型皂苷降解产物，在天然人参中并不存在，是Hasegawa[19]用土壤细菌降解人参皂苷Rb1、Rb2与Rc时发现的，是原人参二醇型皂苷在体内吸收和发挥作用的真正实体。有证据表明，CK对多种炎症细胞模型的作用优于色甘酸二钠或地塞米松。细胞和分子水平进一步研究发现，CK下调IL-1β和TNF-α mRNA表达，同时抑制NF-κB及MAPK的活性并可下调NOS与COX-2基因表达，从而减少NO的释放而发挥抗炎作用。

本课题中体外实验证明，人参皂苷CK可抑制LPS诱导的原代培养小胶质细胞的激活，并可显著降低培养液中NO含量和细胞内ROS含量，证明人参皂苷CK不仅抑制小胶质细胞激活，而且可进一步抑制其激活后氧化应激及炎症反应，这可能是人参皂苷CK抗炎和神经保护的共同作用机制。体内和体外实验结果证实，人参皂苷CK具有良好的抗炎和神经保护作用，可抑制小胶质细胞的激活并可抑制细胞因子、炎症介质等的释放，为其进一步开发成为抗炎和神经保护药物，特别是治疗老年痴呆等神经退行性疾病的药物提供了一定的实验依据。

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（收稿日期：2013-03-07 本文编辑：程 铭）