姐妹染色单体互换频率影响因素的研究

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摘要： ［目的］探讨影响姐妹染色单体互换（SCE）频率的因素。 ［方法］按微量全血培养法，对SCE培养至6 h加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）后继续培养，对下列3个因素进行研究。①实验条件（a.培养时加入BrdU的浓度：5、10、20、30 μg/ml 4个点，b.加BrdU后自然光下曝光时间：0、0.5、30、60及120 min 5个点，c.培养时间：56和72 h 2个点）；②接触有害物质因素［接触苯并（a）芘等沥青作业工人34名］；③吸烟因素（吸烟者32名）。 ［结果］①在实验条件中，SCE值随着BrdU浓度的增加而增加，10 μg/ml（最佳实验点）和20 μg/ml分别为（5.82±1.85）和（6.83±2.37）次/细胞，差异已有显著性（P < 0.01）；随着曝光时间的延长SCE值亦随之升高，0.5和30 min的结果比较差异已有显著性（P < 0.01），SCE值分别为（5.88±1.94）和（8.69±2.52）次/细胞，但培养时间对SCE频率无影响；②沥青作业组的SCE值比对照组显著升高，分别为（10.81±1.74）和（6.64±1.52）次/细胞，差异有显著性（P < 0.01）；③吸烟组的SCE值比非吸烟者（对照组）显著升高，分别为（9.57±1.63）和（6.64±1.52）次/细胞，差异有显著性（P < 0.01）。 ［结论］BrdU浓度、曝光时间、接触某些有害物质作业和吸烟等因素对SCE结果均有较大的影响。

关键词：姐妹染色单体互换；BrdU浓度；曝光时间；有毒物质；吸烟

Research on Incidence of Sister Chromatid Exchange and Its Influencing Factors ZHENG Qiao-ling，LI Wei-jun，GUO Yi-cao（Guangdong Prevention and Treatment Center for Occupational Diseases，Guangzhou 510300，China）

Abstract： ［Objective］ To investigate the incidence of sister chromatid exchange（SCE）and its influencing factors. ［Methods］ The culturing method of whole blood was carried out，then BrdU was added after the samples cultured for 6 hours. Three influencing factors of BrdU was tested as follows: （1）the experimental environment，including（a）the concentrations of BrdU of 5 μg/ml，10 μg/ml，20 μg/ml and 30 μg/ml；（b）the exposure time of 0 min，0.5 min，30 min，60 min and 120 min；and（c）the exposure periods of 56 hours and 72 hours；（2）the exposure condition，34 workers exposed to benzo（a）pyrene；and（3）the smoking habit，32 workers had smoking habit. ［Results］ （1）The incidence of SCE increased significantly with the concentration of BrdU getting higher，the SCE values of the best（10 μg/ml）and 20 μg/ml resulting concentrations of BrdU were observed to be（5.82±1.85）and（6.83±2.37）times per cell respectively，P < 0.01. The SCE values also increased with the exposure time，the value at 0.5 min exposure（5.88±1.94）had significant difference with the value at 30 min value（8.69±2.52），P < 0.01，but the exposure time did not affect SCE frequency apparently. （2）The SCE values of asphalt workers（10.81±1.74）were significantly higher than that of the control（6.64±1.52），P < 0.01. （3）The SCE value of smoking group（9.57±1.63）was also significantly higher than that of non-smoking group（6.64±1.52），P < 0.01.［Conclusion］It suggests that concentration of BrdU，exposure time，some harmful occupational factors and cigarette smoking habit have obvious effects on results of SCE test.

Key Words： sister chromatid exchange；concentration of BrdU；exposure time；harmful factors；cigarette

人外周血姐妹染色单体互换（sister chromatid exchange，SCE）频率是检测DNA损伤极为灵敏的指标，既可用于检测各种诱变因素和致癌因素对人体DNA的损伤，又可作为探讨染色体断裂和修复机制的良好手段；SCE增高表明染色体不稳定或修复能力低下，意味着DNA受损。因SCE分析技术简便、灵敏度高，现已成为遗传毒理学中成熟的研究方法之一［1，2］。但也正是由于该方法的上述特点，因而影响因素较多，且目前国内还没有公认的标准化方法，故不同的论文报告中正常人（对照组）SCE均值差别较大，有的低至（2.00±0.52）次/细胞［3］，有的高达（9.2±1.8）次/细胞［4］。为此，根据本实验室的多年工作经验和教训，对影响SCE的某些因素进行了研究，现报告如下。

1 对象和方法

1.1 研究对象及分组

选择不吸烟、排除有害接触史的健康成人6名为实验条件组，男女各3人，年龄22～25岁。取静脉血进行实验方法中的影响因素研究。接触组为沥青作业工人34人，男性23名、女性11名，年龄18～47（32.3±4.6）岁，工龄1.5～19（10.6±2.9）年。对照组为不接触毒物、健康的办公室人员32人，男性20名、女性12名，年龄为19～50（34.1±5.1）岁。接触组和对照组性别、年龄比较差异均无显著性（P > 0.05），两组人员均不吸烟、嗜酒。吸烟组为某厂只吸烟、不嗜酒、不接触毒物的健康行政人员32人（每天吸烟>20支、烟龄>1年），年龄21～53（36.6±5.4）岁，年龄与对照组比较差异无显著性（P > 0.05）。

1.2 方法

1.2.1SCE标本的培养与制作①取观察对象外周静脉血按本实验室微量全血培养法培养［5］，培养至6 h时加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU，Sigma产品），使终浓度为10 μg/ml，继续培养至终止前12 h加秋水仙素，全程培养56 h，除实验需要外，培养过程均避光；②姐妹染色单体差别染色：培养的标本经常规制片后，根据PERRY等［6］的方法改进，即不使用荧光素染色、标本不经老化处理，直接将玻片标本置于载板上，标本面朝上，用2×SSC液（0.3 mol/L氯化钠、0.03 mol/L柠檬酸钠等量混合）加在玻片上，在56 ℃条件下，用30 W紫外光管距标本4～6 cm的高度照射30 min，蒸馏水冲洗，经Giemsa染色后，显微镜下即可观察到姐妹染色单体的差别染色。

1.2.2SCE计数选择分散和差别染色良好、数目为46条染色体的第二代中期分裂细胞分析SCE，实验组每一实验点分析240个细胞、其他组每人分析20个细胞，在染色单体末端发生互换者记1次SCE，在中间互换者记2次，被判明在着丝点处互换者也计1次，各实验点结果以平均每细胞的SCE数和标准差表示。

1.3 研究内容

1.3.3 实验条件①BrdU浓度实验：于培养体系中加入BrdU系列终浓度分别为：5、10、20、30 μg/ml 4个点；②曝光实验：将加完BrdU后的培养物置于室内自然光充足处作自然曝光处理，时间分别为：0、0.5、30、60及120 min 5个点；③培养时间实验：分别作56和72 h培养及观察细胞代数的比例。

1.3.2 接触有害物质因素对沥青作业工人［苯并（a）芘的车间空气浓度为0.76～4.81 ng/m3，n =6］和对照组的SCE比较。

1.3.3 吸烟因素 对吸烟组与对照组的SCE比较。

1.4 统计学分析

采用Microsoft Excel建立数据库，进行方差分析，q检验和t检验等。

2 结果

2.1 培养体系中加入不同BrdU浓度的SCE结果

在BrdU培养浓度实验中，随着BrdU终浓度增加，SCE均值亦随之升高。虽然5 μg/ml点的SCE均值最低，但在个别标本中可能由于BrdU的含量不足，致使差别染色不够清晰，因此此结果未列入统计分析。10、20和30 μg/ml的SCE浓度染色结果清晰，对于结果分析稳定。统计学分析结果显示各组间的差异均有非常显著性（P < 0.01）。因此，BrdU浓度为10 μg/ml点为显示清晰的SCE最低浓度（最佳浓度点）（表1）。

2.2 不同曝光时间的SCE结果

用BrdU终浓度为10 μg/ml培养，经不同时间曝光后，SCE结果随着曝光时间的延长均值亦随之升高，但曝光时间0与0.5 min的SCE结果比较，差异无显著性（P > 0.05），0.5 min与30 min或以上组比较，差异均有显著性（P < 0.01）（表1）。

2.3 不同培养时间的SCE结果

用BrdU终浓度为10 μg/ml、不曝光，经培养56和72 h后，SCE的结果差异无显著性（P > 0.05）；细胞代数比例的观察56 h培养收获的第二代细胞比例比72 h培养者高（表2）。

2.4 接触组和对照组的SCE结果

用BrdU终浓度为10 μg/ml、不曝光、培养56 h对接触沥青组和对照组比较，结果分别为（10.81±1.74）和（6.64±1.52）次/细胞，差异有显著性（P < 0.01）。

2.5 吸烟与非吸烟的SCE结果

用BrdU终浓度为10 μg/ml、不曝光、培养56 h对吸烟与不吸烟比较，结果分别为（9.57±1.63）和（6.64±1.52）次/细胞，吸烟组高于非吸烟组，差异有显著性（P < 0.01）。

3 讨论

SCE的形成包括了DNA损伤引起的继发性修复和DNA合成两个过程，与DNA的稳定性有关。DNA损伤增加或修复能力削弱均可增加SCE的频率。本文结果显示，实验条件、接触某些毒物和吸烟因素对SCE频率均有较大的影响。

BrdU是一个诱变剂［7］，具有致突变作用，本身亦可致使SCE的增加。在实验中控制其浓度是很必要的。虽然5 μg/ml点的SCE均值最低，但在个别标本中差别染色不够清晰，因此，选择终浓度为>5～10 μg/ml较为适宜。

由于BrdU具有遇光易分解的特性，我们加完BrdU后立即做曝光处理，检测其产物的毒性，结果表明BrdU光解产物比其本身的毒性增强。因为培养时加BrdU和秋水仙素是不可避免的，最好选择在暗室中红光或黄光下操作（若无条件时也可选择光线较暗的黄昏时刻快速完成），据我们多年的操作，一个标本加上述2种试剂累计时间在0.5 min内可完成，培养较多样本时，为了保持实验的可比性，可采取分批加试剂，缩短曝光时间，全过程总曝光时间应控制在0.5 min内为宜。

培养时间对SCE值影响不大，但考虑到第二代细胞56 h的培养比例高于72 h，后者不仅时间长而且由于后期BrdU浓度的降低可使第二代细胞清晰度变差，因此彩用56 h培养更佳。

沥青作业中含有一些有害因素物质如多环芳烃类，而苯并（a）芘广泛存在于多环芳烃类化合物中，是目前被认为可能的人类致癌因素。动物实验证明苯并（a）芘可诱发肝癌、肺癌［8］。苯并（a）芘本身不是活性物质，但当其存在于机体内时经过混合功能氧化酶的作用，可以代谢转化为活性物质，与DNA发生共价结合，而引起DNA的改变，增加SCE的频率。本研究的结果SCE频率比对照组差异有显著性（P < 0.01），表明接触某些有害因素对SCE的影响较大。可用本指标对某些有害因素的接触工人进行遗传毒性效应的监测。

香烟烟雾中含有大量的毒性物质，吸烟、被动吸烟可致淋巴细胞DNA的损伤［9］。本研究结果亦显示，吸烟组的SCE频率比不吸烟组显著增加，表明吸烟可增加SCE的频率。

综上所述，影响人外周血淋巴细胞SCE频率的因素较多，在实验设计及结果评价时也应充分考虑理化因素的影响；对实际研究中难以避免的因素如吸烟，建立本底值可提高对比性；实验方法中的影响因素控制很重要，应确定最佳的实验条件并在整个实验中使各种实验条件始终保持一致。

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（收稿日期：2006-03-23）

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