三七总皂苷对β―淀粉样蛋白42损伤脑微血管内皮细胞ZO―1表达的影响

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摘要：目的 观察三七总皂苷对β-淀粉样蛋白（Aβ）42损伤脑微血管内皮细胞zo-1表达的影响，为阿尔茨海默病的对因治疗提供新的依据。方法 细胞分为正常对照组、模型组和三七总皂苷低、中、高剂量组，37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，采用MTT比色法检测细胞活力，Western blot检测ZO-1蛋白表达。结果 Aβ42刺激后微血管内皮细胞活力降低（P

关键词：三七总皂苷；阿尔茨海默病；β-淀粉样蛋白42；ZO-1蛋白

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.08.016

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）08-0057-03

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是发生在中老年人群中的痴呆性疾病，也是最常见的神经退

基金项目：国家自然科学基金（81173229、81202686）；北京中医药大学实验室开放课题（2011-SYSKFKT-01-2）

通讯作者：高永红，E-mail：

行性疾病之一。AD具有一项特征性的病理变化――老年斑。老年斑的主要成分是β-淀粉样蛋白（β- amyloid，Aβ），Aβ的肽链长短各有不同，沉积于老年斑核心的通常为Aβ1-42/43，并掺杂Aβ1-40。Aβ42较Aβ40更易聚集且神经毒性强，能够迅速集结成淀粉蛋白纤维，可能成为以后Aβ聚集与沉积的开端[1]。研究表明，AD患者脑中可溶性Aβ主要并长期来源于血液[2-4]。血脑屏障能够选择性地允许某些物质由外周血循环入脑，对保持脑内环境稳定有着重要的意义。毛细血管内皮细胞和细胞间紧密连接是血脑屏障的基本结构，而血脑屏障通透性的改变又与紧密连接的主要成分ZO-1分布及缺失密切相关[5]。故在AD发病机制的过程中，研究Aβ在大脑中沉积并导致血脑屏障上主要功能蛋白ZO-1的病理改变具有重要的意义。目前三七已广泛应用于脑血管疾病的治疗中，其主要有效成分三七总皂苷对AD模型动物有着良好的治疗作用[6]。本实验在前期工作的基础上，进一步探讨三七总皂苷对Aβ42损伤脑微血管内皮细胞ZO-1表达的影响，为AD的对因治疗提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 细胞

BalB/c小鼠脑微血管内皮细胞系细胞（中日友好医院娄晋宁教授惠赠），经抗Ⅷ因子抗体、抗CD31抗体及Dil-乙酰化低密度脂蛋白标记摄取检测，符合内皮细胞特性[7]。

1.2 主要药物与试剂

注射用血塞通（冻干，三七总皂苷，400 mg，哈尔滨珍宝制药，批号A20111101）。Aβ42（杭州中肽生化有限公司，批号CL-05-00776），胎牛血清（PAA公司），内皮细胞生长因子（中日友好医院临床研究所病理生理室提取），明胶（Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO）、MTT（北京索莱宝科技有限公司），硝酸纤维素膜（美国Millipore 公司），BCA蛋白定量测定试剂盒、RIPA裂解液、ECL发光液（北京普利莱基因技术有限公司），蛋白marker（美国MBI公司），Rabbit anti-ZO-1单克隆抗体（美国invitrogen公司）。

1.3 主要仪器

倒置相差显微镜及成像系统（德国Leica公司，4000B），CO2细胞培养箱（SANYO公司），超净工作台（新加坡ESCO公司）。

1.4 细胞培养

将细胞接种至已用2%明胶包被的培养瓶中，加入适量内皮细胞培养基（DMEM培养基中添加20%胎牛血清、谷氨酰胺2 mmol/L、青霉素100 000 U/L、链霉素100 mg/L、肝素40 000 U/L、内皮细胞生长因子100 mg/L）；37 ℃、5%CO2培养箱培养，2～3 d换液1次，细胞80%融合时传代，实验使用第26代细胞。

1.5 β-淀粉样蛋白42孵育

将1 mg Aβ42用于HFIP，通风橱干燥挥发后，加入44 μL DMSO溶解，PBS稀释至0.1 mmol/L，过滤除菌，分装，4 ℃放置24 h，-20 ℃冻存备用。用时以DMEM稀释至5 μmoL/L。

1.6 分组

将单细胞悬液以1×105/mL浓度接种在培养板中，培养48 h，分为正常对照组（A组，DMEM培养基）、模型组（B组，5 μmol/L Aβ42）和三七总皂苷低、中、高浓度组（C、D、E组，25、50、100 μg/mL三七总皂苷），在37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。

1.7 MTT比色法检测细胞活力

孵育结束后，吸弃上清液，每孔加入100 μL MTT溶液（1 mg/mL，用无血清的DMEM配制），置细胞培养箱内37 ℃避光孵育4 h；吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，轻轻震荡10 min，使Formaza结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪选择492 nm波长检测细胞活力（A值）。

1.8 Western blot检测ZO-1蛋白表达

6孔板中每孔加0.2 mL裂解缓冲液，冰浴条件下行超声破碎，4 ℃，13 000 r/min离心10 min，取上清进行蛋白定量，等体积加入2×蛋白上样缓冲液，100 ℃煮沸20 min。将样本蛋白行SDS-PAGE（10%）电泳，电转移于硝酸纤维素（NC）膜上，5%脱脂奶粉室 温封闭1 h，1∶1000加入一抗，4 ℃孵育过夜，以含0.05%吐温的PBS（TBS）洗涤3次，加入辣根过氧化酶标的羊抗兔IgG抗体（1∶6000，santa cruz公司）。室温孵育1 h，以TBS液冲洗3次，ECL化学发光法显影。

1.9 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据用―x±s表示，采用方差分析。P

2 结果

2.1 三七总皂苷对脑微血管内皮细胞活力的影响

在通过Aβ42刺激后，与A组比较，B组内皮细胞活力明显降低，表明Aβ42的刺激能够降低微血管内皮细胞的活力（P

注：与A组比较，##P

图1 各组脑微血管内皮细胞活力比较

2.2 三七总皂苷对脑微血管内皮细胞ZO-1蛋白表达的影响

与A组比较，B组ZO-1表达量明显降低，表明通过Aβ42刺激能够显著抑制ZO-1蛋白的表达（P

图2 各组脑微血管内皮细胞ZO-1表达

3 讨论

AD的发病机制至今尚未阐明。但在显微镜下可看到AD存在一些特征性病理变化：老年斑和神经纤维缠结样变（NFT），甚至在某些脑区出现大量神经元丢失[8]。在对AD的发病机制的研究中，Aβ在AD患者脑中聚集和沉积形成老年斑，启动病理级联反应，形成NFT导致广泛神经元丢失已被公认为AD重要的致病原因[9]。Aβ源自Aβ前体蛋白（APP），主要以Aβ40和Aβ42两种形式存在，其中Aβ42较Aβ40更易沉积，是主要的致病形式，能沉淀形成老年斑[10]。有研究指出，AD患者脑中可溶性Aβ主要并长期来源于血液[2-4]。而可溶性Aβ在正常生理条件下，由于大脑内的血脑屏障发挥着正常的屏障功能而无法大量通过脑微血管转运进入脑内。

血脑屏障是存在于血液和脑组织之间的一层屏障系统，其内皮细胞之间的紧密连接和黏着连接构成。紧密连接是构成血脑屏障的结构基础，包括膜内在蛋白和胞质辅助蛋白[11]。在紧密连接的构成及功能等方面发挥重要作用的胞质附着蛋白家族，尤其是ZO-1的缺失、分裂，与屏障渗透性的增加有着密切的关系[5]。正常情况下，ZO-1对维持紧密连接的连续性和完整性发挥重要作用。有研究表明，氧化剂诱导的内皮细胞屏障功能的破坏过程中，ZO-1表达显著减少[12]。

三七具有益气、活血、化瘀之功，广泛应用于脑血管疾病的治疗中，其主要有效成分三七总皂苷具有明显的抗衰老、抗痴呆作用，对AD模型动物有着良好的治疗作用[5]。故本实验采用Aβ42损伤微血管内皮细胞，观察三七总皂苷对Aβ42损伤脑微血管内皮细胞ZO-1表达的影响，实验结果表明，在Aβ42的刺激下，微血管内皮细胞的活力明显降低，并且能够显著抑制ZO-1蛋白的表达。而三七总皂苷各组则能有效抑制Aβ42对微血管内皮细胞活力的降低，恢复血脑屏障的部分屏障功能，此功效也随着三七总皂苷剂量的增加而加强；而在ZO-1表达量上，三七总皂苷低、中剂量组能够在有Aβ42刺激的前提下有效增加ZO-1蛋白的表达，尤以中剂量组的表现显著。但值得注意的是，高剂量组并没有显著提高ZO-1的表达量，反而有降低趋势，表明虽然高剂量组能够提高微血管内皮细胞的活力，但并不能平行地增加ZO-1蛋白的表达，还需进一步研究。

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（收稿日期：2014-02-12；编辑：华强）