不同氮源对三角褐指藻生长和脂类含量的影响

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摘要：研究了不同氮源及浓度对三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）的生长、总脂及脂肪酸组成的影响。结果表明，三角褐指藻在氮源缺乏时生长缓慢，表现出油脂积累的特性。以初始浓度大于3.9 mmol/L的氯化铵作为氮源，可以促进三角褐指藻生物量和油脂含量的同步增长。高浓度的尿素有利于三角褐指藻的生长，但达到8.0 mmol/L时脂肪含量下降。不同浓度硝酸钠都促进三角褐指藻的生长，但不能促进脂肪的积累。脂肪酸组成分析表明，单不饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例为45%～50%，受各种氮源变化的影响较小，可为生物柴油提供较好的流动性。氮源的添加有利于二十碳五烯酸（EPA）和多不饱和脂肪酸（PUFAs）的合成，当氯化铵浓度为3.9 mmol/L时，EPA和PUFAs占总脂肪酸的比例达到最大，分别为20.4%和26.7%。

关键词：氮源；三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）；生长；脂肪；脂肪酸组成

中图分类号：Q949.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）23-5311-04

Effects of Nitrogen Sources on the Growth and Lipid Content of

Phaeodactylum tricornutum

WANG Yi，FU Ru，PEI Guo-feng，WANG Hai-ying

（Key Lab for Microorganisms and Biotransformation， South-central University for Nationalities， Wuhan 430074，China）

Abstract：Effects of different nitrogen sources and their concentrations on the growth， total lipids and fatty acids composition of Phaeodactylum tricornutum were studied. The results showed that P. tricornutum growed poorly in cultures without addition of any nitrogen source， but accumulated lipids effectively. The biomass and lipid content of P. tricornutum were promoted simultaneously with more than 3.9 mmol/L of initial ammonium chloride in medium； 8.0 mmol/L of urea enhanced the biomass of algae while decreased the lipid content； in the range of tested concentration， sodium nitrate promoted growth of algae and depressed the accumulation of lipid. The fatty acids composition analysis showed that monounsaturated fatty acid（MPUAs） accounted for 45%～50% of the total fatty acids and was less affected by nitrogen sources， thus provided better mobility for biodiesel. The synthesis of C20∶5（n-3）（EPA） and polyunsaturated fatty acid（PUFAs） were increased with addition of nitrogen sources. With 3.9 mmol/L of ammonium chloride， the ratio of EPA and PUFAs to total fatty acids was the highest， 20.4% and 26.7%， respectively.

Key words： nitrogen sources； Phaeodactylum tricornutum； growth； lipid content； fatty acids composition

微藻具有光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物产量高等特点，被认为是最有前途的新型生物柴油原料之一[1，2]。三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）在分类学上隶属于硅藻门，生长速度快，油脂含量可达干重的10.0%～ 31.5%，是一种极具开发潜力的优质经济藻种资源[2]。王付冬等[3]报道三角褐指藻总脂含量随光照的增强而成上升趋势；夏金兰等[4]报道三角褐指藻脂肪含量随培养基中Fe3+浓度而变化，在Fe3+浓度为1×10-4 mol/L时，其脂质含量达到47.3%。因而改变环境因子和培养基成分可以调控三角褐指藻生物量和油脂含量。研究不同氮源及浓度对1株三角褐指藻的生长、总脂含量及脂肪酸组成的影响，筛选适宜微藻生长及油脂积累的氮源，明确其适宜浓度范围，从而为三角褐指藻的生物质能研究开发提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 三角褐指藻培养

试验用三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）由中南民族大学生命科学学院发酵工程实验室保存，经抗生素法制备无菌藻株。种子培养基按照f/2配制，500 mL三角瓶装300 mL培养基。种子培养液以10%（V/V）接种量接种于培养基中，静置培养18 d，培养温度（20±1）℃，光照度为3 500 lx，光暗比12 h∶12 h，每天光照期间摇瓶3次，并随机更换三角瓶位置以避免光照不均。以没有添加硝酸钠的f/2培养基作为对照，选取硝酸钠﹑氯化铵和尿素做为氮源，分别设定1.0、2.1、3.9及8.0 mmol/L 4个浓度梯度进行试验，每个浓度做3次平行试验。从接种当天开始，每隔1 d取出少量藻液用血球计数板计数。

1.2 藻细胞收获

培养液经6 000 r/min离心5 min后弃上清，藻细胞沉淀用去离子水离心洗涤2次，冷冻干燥后所得藻粉称重，用于油脂测定。

1.3 油脂含量测定

氯仿-甲醇法提取油脂[5]。室温下0.3 g藻粉加入3 mL提取溶剂（氯仿∶甲醇=2∶1），超声提取约10 min。然后6 000 r/min离心5 min，取下部油脂层。重复3～5次，合并所有油脂层溶液于80 ℃水浴蒸干溶剂，然后置40 ℃烘箱中干燥至恒重。油脂含量=（油脂质量/干藻粉质量）×100%。

1.4 脂肪酸成分及含量测定方法

1.4.1 脂肪提取与甲酯化 取30.0 mg冻干藻粉，放入带螺帽的水解管内，加2 mL CHCl3-CH3OH混合液（体积比为2∶1），充N2 1 min后密闭封口。超声萃取3 min （33 kHz，300 W），移出上层清液。重复3次并合并萃取液，移入带螺帽试管，加0.3 mL正十七酸内标液（0.4 g/L，CHCl3-CH3OH溶解）。N2吹干后，加0.5 mol/L的KOH-CH3OH溶液1 mL，充氮密封，迅速混匀后置70～80 ℃水浴皂化15 min。冷却至室温后加入三氟化硼甲醇溶液1 mL，充氮密封，振荡1 min，然后70～80 ℃水浴甲酯化30 min。冷却至室温，准确加入正己烷2.0 mL，振荡混匀。再加入饱和NaCl溶液2.0 mL，振荡后静置，取上层清液，氮气吹干[6]。准确加入正己烷1.0 mL，氮气密封，准备进样。所有操作应该在低光照和氮气保护下进行，样品置于超低温冰箱中保存，进样前加入饱和NaCl溶液，取上层清液3 μL进样。

1.4.2 气相色谱测定脂肪酸含量 Agilent6890N气相色谱仪，毛细管色谱柱HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm，5% Phenyl Siloxane）。进样口温度250 ℃，氢火焰离子化检测器（FID）温度为300 ℃，载气N2流量1.0 mL/min，分流比为30∶1。空气流量350 mL/min，H2流量30 mL/min。柱温程序升温：第一段，起始温度150 ℃，10 ℃/min升温至210 ℃；第二段，柱温210 ℃，3 ℃/min升温至250 ℃，恒温25 min。以面积归一化法得到各脂肪酸组分的相对百分含量。

1.5 数据处理

用统计软件GraphPad Prism 5进行数据差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 氮源及浓度对三角褐指藻生长的影响

氮源及其浓度对三角褐指藻生长的影响见图1，从生长曲线可知不添加氮源时微藻生长缓慢。试验各浓度的硝酸钠均显著促进了三角褐指藻的生长，但各组之间的生长无显著差异（P>0.05）。氯化铵和尿素浓度从1.0 mmol/L增加至2.1 mmol/L时，生长明显加快，浓度继续增加则减缓了藻的生长。主要是因为高浓度的氯化铵在培养过程中会导致培养液pH较大的改变，从而抑制微藻的生长。

2.2 氮源对三角褐指藻总脂含量的影响

试验结果表明，不添加氮源时三角褐指藻脂质含量显著高于添加氮源的试验组，为24.51%（图2）。以硝酸钠为氮源，三角褐指藻总脂含量较低，且各组间无显著差异（P>0.05）；以氯化铵为氮源，随着浓度的增加，脂质含量增加，在氯化铵为8.0 mmol/L时达到24.93%；尿素浓度为3.9 mmol/L时，脂质含量达到18.87%。Shifrin等[7]报道了30种不同的绿藻和硅藻在氮缺乏条件下都能够积累脂质，本试验结果也验证了这一点，王顺昌等[8]研究表明在以不同氮源作为培养基时，导致藻类中性脂肪变化的主要因素是培养液pH的改变，而非氮源本身的作用，以尿素和氯化铵作为氮源脂质积累较大的差异可能是由于培养过程pH的变化引起的。

2.3 氮源对三角褐指藻脂肪酸组成的影响

三角褐指藻脂肪酸组成的变化见表1至表3。大量研究表明，几乎所有硅藻都含有较多的C14∶0、C16∶0、C16∶1（n-7）和C20∶5（n-3）（EPA）脂肪酸，C18和C22不饱和脂肪酸的含量则较低[9]。该株三角褐指藻的脂肪酸组成与已报道的结果比较，C18占总脂肪酸的比例较高，添加氮源后C18脂肪酸占总脂肪酸的比例达到7.25%～13.64%。C16∶1占总脂肪酸的比例最高，但受氮源种类和浓度影响较小。添加氮源后，C18∶3n6占总脂肪酸的比例明显下降，饱和脂肪酸（SFAs）占总脂肪酸的比例与对照相比显著降低（P

三角褐指藻中的单不饱和脂肪酸（MPUAs）占总脂肪酸的45%～50%，可以为生物柴油提供较好的流动性。添加氮源培养后，EPA和PUFAs占总脂肪酸的比例明显提高，分别达到10%和20%以上，PUFAs，尤其是EPA会影响生物柴油的储藏稳定性从而减弱其适用性，但藻油中多于4个双键的脂肪酸很容易催化氢化[2]。

3 结论

综上所述，在大量快速培养三角褐指藻作为生物柴油原料时，可以选择合适的氮源如氯化铵，在获得较高生物量的同时促进藻细胞积累较多的油脂；脂肪酸组成分析表明三角褐指藻中的EPA和PUFAs的含量较高，会影响生物柴油的储藏稳定性，但由于不饱和脂肪酸的催化氢化很容易实现，也不会成为其作为生物柴油油源的障碍。

参考文献：

[1] 宋东辉，侯李君，施定基.生物柴油原料资源高油脂微藻的开发利用[J].生物工程学报，2008，24（3）：341-348.

[2] CHISTI Y.Biodiesel from microalgae[J]. Biotechnology Advances，2007，25（3）：294-306.

[3] 王付冬，桑 敏，李爱芬，等. 光照对眼点拟微绿球藻和三角褐指藻生长及总脂的影响[J]. 中国油脂，2010，35（6）：71-75.

[4] 夏金兰，李 丽，万民熙，等. 两株微藻的分离鉴定及Fe3+对其生长和脂质积累的影响[J]. 武汉大学学报（理学版），2010，56（3）：325-330.

[5] BLIGH E G， DYER W J. A rapid method of total lipid extraction and purification[J].Canadian Journal of Physiology and Pharmacology，1959，37（8）：911-917.

[6] SLOVER H， LANZA E. Quantitative analysis of food fatty acids by capillary gas chromatography[J].Journal of the American Oil Chemists' Society，1979，56（12）：933-943.

[7] SHIFRIN N S， CHISHOLM S W. Phytoplankton lipids： interspecific differences and effects of nitrate， silicate and light-dark cycles[J]. Journal of Phycology，1981，17（4）：374-384.

[8] 王顺昌，王 陶，赵世光，等.不同氮源对蛋白核小球藻生长、色素和中性脂肪积累的影响[J].激光生物学报，2008，17（2）：197-201.

[9] ZHUKOVA N V，AIZDAICHER N A. Fatty acid composition of 15 species of marine microalgae[J].Phytochemisty，1995，39：351-356.

[10] 刘梅芳，王海英.氮源及其浓度对三角褐指藻生长及其脂肪酸组成的影响[J].中南民族大学学报（自然科学版），2008，27（2）：32-35.