AKT基因被RNA干扰抑制后对卵巢癌SKOV3细胞增殖及凋亡的影响

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇AKT基因被RNA干扰抑制后对卵巢癌SKOV3细胞增殖及凋亡的影响范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

【摘要】 目的 通过rna干扰技术阻断卵巢癌SKOV3细胞中akt基因的表达，研究其对卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响。方法 人卵巢癌SKOV3细胞体外培养，分为对照组、空白载体组与RNA干扰组三组，采用MTT法与流式细胞仪AnnexinV/PI法检测并评价AKT基因干扰后对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响。结果 MTT结果显示RNA干扰组细胞增殖能力较对照组与空白载体组明显降低，差异具有统计学意义（P0.05）；流式细胞仪AnnexinV／PI法检测结果显示，RNA干扰组细胞凋亡率高达到（79.52±2.31）%，较对照组与空白载体组明显升高，约是空白载体组与对照组的3倍，差别具有统计学意义（P

【关键词】 AKT基因； 卵巢癌； siRNA； 增殖； 凋亡

The effect of RNA interference inhibited gene AKT on proliferation and apoptosis of ovarian cancer SKOV3 cells LIU Xiao-wen*，HU Ming-ying.*Weifang Medical University.Weifang 261000，China

【Abstract】 Objective To inhibit the key gene AKT of SKOV3 cells by RNA interference and study the effect of RNA interference on ovarian cancer cell proliferation and apoptosis.Methods Human ovarian carcinoma SKOV3 cells in vitro were divided into the control group，the empty vector group and the RNA interference group.The ovarian cancer cell proliferation，apoptosis was evaluated by MTT method and flow cytometry AnnexinV/PI assay in each group.Results MTT results showed that the cell proliferation in the RNA interference group was significantly lower as compared with the control group and the empty vector group (P 0.05).The flow cytometry AnnexinV/PI assay showed that the apoptosis rate of RNA interference group ((79.52 ± 2.31)%) was significantly higher than that of the empty vector (P

【Key words】 AKT gene； siRNA； Proliferation； Apoptosis

卵巢癌是发生于卵巢组织的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势。但其发病机制尚不清楚，原癌基因的过度表达和抑癌基因的突变被认为是其主要发病机制之一。因而，在基因水平研究卵巢癌的治疗成为近年来的热点。RNA干扰技术能有效地抑制特定基因的表达，它的效果在多种肿瘤细胞系的实验中已被证实。近年来有研究表明，PI3K/AKT信号通路与卵巢癌有密切的关系［1］。为证实这一研究，本实验以PI3K/AKT信号通路的下游基因AKT为靶点，通过RNA干扰技术抑制其表达，以探讨其对人卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响。

1 资料与方法

1.1 材料 人卵巢癌skov3细胞株以及Mc-coy5A培养基（中国科学院上海细胞生物研究所），Lipofectamine2000（Invitrogen公司），细胞总RNA提取和RT-PCR试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma公司），AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），靶向AKT基因的siRNA由上海吉玛制药技术有限公司设计与合成：（AKT-homo-413）正义链CCUGGGUAAAGAAGUCAATT，反义链UUGACUUCUUUGACCCAGGTT。

1.2 主要仪器 超净工作台，CO2培养箱，酶标仪，流式细胞仪等均有潍坊医学院实验中心提供。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与转染 人卵巢癌SKOV3细胞株用10%胎牛血清的Mc-coy5A培养基常规培养并传代。将细胞分为三组：对照组、空白载体组与RNA干扰组。RNA干扰组：转染实验操作步骤按照Lipofectamine 2000TM产品说明书，转染前1天将5×104个细胞/孔接种于24孔培养板，细胞融合为90%～95%时进行转染，用无血清无抗生素的培养基稀释siRNA和Lipofectamine 2000，转染后6 h更换培养基，48 h后进行转染后的检测。空白载体组只添加Lipofectamine 2000，其余操作步骤同RNA干扰组。

1.3.2 细胞增殖的检测 将细胞制成细胞悬液，按4×103个细胞/孔将三组卵巢癌细胞接种于96孔板中，每组细胞设5个孔及1个空白对照组，每孔加培养基100 μl和MTT液10 μl。置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内继续孵育4 h，弃去孔内液体加入DMSO 100 μl后混匀并于接种后24 h、48 h、72 h时进行细胞增殖检测。酶标仪570 nm处测定各孔的吸光度（A值），A值越大，则表示细胞生长速度越快。

1.3.3 细胞凋亡率的检测 取对数生长期的三组细胞用0.25%的胰酶消化后，2000转离心5 min，调整细胞浓度为1×106/ml，以500 μl的结合缓冲液重悬，加入5 μl的Annexin V-FITC混匀，再加入5μl PI，混匀后避光，室温反应15 min，同时设阴性对照（不加Annexin V-FITC和PI），行流式细胞仪（美国BD公司产品）检测细胞凋亡率。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，三组间比较采用t检验，结果均以均数±标准差（x±s）表示，P

2 结果

2.1 细胞增殖的检测结果 应用MTT法检测三组细胞增殖的结果：RNA干扰组的增殖能力测定值显著低于对照组，差异有统计学意义（P

2.2 细胞凋亡率的检测结果 流式细胞仪法对三组细胞进行检测，自动分析细胞凋亡率。结果显示，RNA干扰组细胞凋亡率显著高于对照组，差异有统计学意义（P

3 讨论

PI3K/AKT信号通路参与很多重要的生物学过程的调控，但其过度激活可导致肿瘤的发生，在正常的组织中PI3K/AKT信号转导途径处于活化状态，但是该通路如果被过度激活，则可刺激蛋白质合成，抑制细胞凋亡等导致肿瘤的无限增殖，成为肿瘤预后不良的标志［2］。近年来，PI3K/AKT信号通路备受关注，它已被认为是肿瘤抗凋亡的主要机制之一。目前，以该通路为靶点的肿瘤治疗策略正在发展中，阻断PI3K／AKT通路也成为目前多种肿瘤治疗的热点之一［3］。相关研究指出，PI3K在约80%的早期卵巢癌细胞和一些上皮性卵巢癌中的表达均有所增高［4］。如果能有效地阻断PI3K/AKT信号通路，将为卵巢癌的治疗提供一个新的方向。

RNA干扰（RNAi）是指由双链RNA引发的转录后基因沉默机制，它通过具有序列特异性的双链RNA（dsRNA）或短发夹状RNA（shRNA）与靶基因mRNA结合而导致目的基因表达下调［5，6］。RNAi技术作为一种简单、有效的工具，对目的基因有很强的抑制作用，在癌基因组功能研究和肿瘤的基因治疗中已显示出优势［7］。siRNA表达载体因具有简便、快速、成本低、转染效率高、便于稳定筛选等优点，极大促进了RNA干扰技术的应用［8］。RNA干扰技术可以选择性地沉默目的基因，抑制目的基因的表达，从而达到抑制肿瘤的增殖生长，对肿瘤起到一定的治疗作用。利用这种技术干扰卵巢癌中的相关基因对卵巢癌的治疗有着积极的作用。

本研究则通过阻断PI3K/AKT信号通路的下游通路AKT的表达，从RNA干扰的水平分析研究AKT被沉默后对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响。结果显示，AKT沉默后细胞的增殖能力明显减低，凋亡率显著增加，这一结果为卵巢癌的基因治疗以及RNA干扰技术提供了有力的证据，为卵巢癌的治疗提供了一个新的方向。卵巢癌的基因治疗以及RNAi技术用于肿瘤基因治疗必将能够成为一种常规的、有效的治疗手段。

参 考 文 献

［1］ 郭瑞霞，魏丽惠.磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号传导通路与妇科恶性肿瘤关系的研究进展［J］.中华妇产科杂志，2005，40(5)：358-360.

［2］ Murakami D，Tsujitani S，Osaki T，et al.Expression of phosphorylated Akt (pAkt) in gastric carcinoma predicts prognosis and efficacy of chemotherapy［J］.Gastric Cancer，2007，10(1):45-51.

［3］ 曾慧敏，红，刘文贤.PI3K/Akt通路与肿瘤治疗［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2008，15(1)：82-85.

［4］ Singh B，Reddy PG，Goberdhan A，et al.P53 regulates cell sunial by inhibiting PIK3CA in squamous cell carcinomas［J］.Genes Dev，2002，16(8):984-993.

［5］ K im VN.Small RNA s classification，biogenesis and function［J］.Mol Cells，2005，9(1):1-15.

［6］ Tomari Y，Zamore PD.Perspective machines for RNAi［J］.Genes Dev，2005，19(5):517-529.

［7］ 祝颖，王旭.RNAi技术应用于妇科肿瘤治疗的研究进展［J］.临床医学工程，2009，16(5)：100-102.

［8］ Paddison PJ，Candy AA，Bemstein E，et al.Short hairp inRNA s (shRNAs) induce sequence specific silencing in m amm alian cells［J］.Genes Dev，2002，16:948-958.

（收稿日期：2011-11-09）