维药苜蓿子的质量综合评价研究
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[摘要] 对不同产地的10批苜蓿子的性状以及显微特征进行了描述；对苜蓿子中胡芦巴碱及盐酸水苏碱进行了薄层色谱（TLC）鉴别；根据2010年版《中国药典》方法；对其杂质、水分、灰分、酸不溶性灰分进行了检测；并建立苜蓿子中胡芦巴碱含量的高效液相色谱（HPLC）测定方法。根据结果暂定药材杂质、水分、灰分、酸不溶性灰分分别不得超过5%，10%，6%，2%；胡芦巴碱质量分数不低于0、795 6 mg・g-1。实验方法准确可靠，以上检测指标和参数可作为制定苜蓿子质量标准的参考依据，为开发利用该药材提供依据。
[关键词] 苜蓿子；质量标准；胡芦巴碱
[收稿日期] 2013-04-23
[基金项目] 国家药典委员会国家药品（维药）标准提高项目（510）
[通信作者] *田树革，教授，研究方向为中药资源化学与质量标准，Tel：（0991）4365195，E-mail：dingding9089@sina、com 苜蓿子是豆科植物紫花苜蓿Medicago sativa的干燥成熟的种子。为维吾尔医常用的药物之一。载于《药物之园》，维语名叫比地乌拉盖，有润便，理血，通经，催乳，强身，生精的功效；常用于大便秘结，贫血，水肿，闭经，乳汁不通，阳痿，体弱病，关节炎，癞皮病等[1]。由于紫花苜蓿在我国作为主要的牲畜饲草作物，在各地均有广阔的种植面积，因此苜蓿子的来源较为分散，不能有效控制苜蓿子药材的质量及用药的安全性。目前的研究多限于对其原植物紫花苜蓿的研究[2-3]，关于其综合质量分析控制内容未见报道，本实验对10个不同批次的苜蓿子的性状特征、显微特征、TLC条件、水分、灰分、酸不溶性灰分检查项、化学成分类型以及含量特征几方面进行探讨，为制定其全面的质量标准提供基础数据，也可为开发苜蓿子这一新疆特色民族药提供实验依据。
1 材料
AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），Mikroskop Primo Star X2005型数码显微镜（德国麦克奥迪公司），4110箱式电阻炉（北京市永光明医疗仪器有限公司），KQ3200DE数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司），CS101鼓风干燥箱（中华人名共和国重庆试验设备厂），岛津（SSL08B01）液相色谱仪。
盐酸水苏碱（中国食品药品检定研究院，批号110712-200508），胡芦巴碱（中国食品药品检定研究院，批号110883-200502）；乙腈为色谱纯，水为娃哈哈饮用水，其他试剂均为分析纯；10批苜蓿子样品采购于维吾尔药店及各个民族药房，产地分别为和田6批，喀什3批，加拿大1批，由新疆医科大学附属中医医院中药鉴定室李永和主任药师鉴定均为豆科植物紫花苜蓿Medicago sativa的干燥成熟果实。
2 方法与结果
2、1 性状鉴别
根据药材的实际情况及相关参考文献修订[4-5] 描述。种子肾形，长2～2、7 mm，宽约1、5 mm；在较大一端有斜截面，凹处有点状种脐，表面均为黄褐、黄绿色，种皮薄，光滑具有光泽，有豆腥味。
2、2 显微鉴别
2、2、1 粉末 将药材粉碎，过6号筛，用解剖针刮取粉末少许，置载玻片上，滴加50%水合氯醛试液适量，在酒精灯火焰上加热透化，再滴加适量稀甘油试液后盖上盖玻片置光学显微镜下观察。栅状细胞多见，胞腔具不规则分枝状孔沟，内含棕色物；支持细胞呈梯状，有条状纹理；子叶细胞和胚乳细胞含有含糊粉粒及油滴（图1）。
2、2、2 横切片 将种子浸泡1 h，用刀片小心切片，置载玻片上，其余方法同粉末切片。外种皮为1列栅状细胞，细胞径向伸长，顶端略尖，外侧有光辉；向内是1列支持细胞，略呈梯状，上部有较大的细胞间隙，向内为薄壁细胞，下有细胞界限不清的棕色的色素层，子叶细胞含糊粉粒及油滴（图2）。
A、栅状细胞及光辉带；B、 营养层薄壁细胞；C、子叶细胞；D、支持细胞。
图1 苜蓿子粉末的显微特征
Fig、1 The microscopic characteristics of Medicago sativa seeds power
A、 10倍镜； B、 40倍镜； 1、胚根； 2、子叶； 3、营养层及残留的内胚乳； 4、维管束； 5、种皮； 6、营养层薄壁细胞； 7、支持细胞； 8、栅状细胞。
图2 苜蓿子横切面特征
Fig、2 Transverse sections of Medicago sativa seeds
2、3 薄层鉴别
称取10批苜蓿子药材各2 g，加甲醇25 mL，超声提取30 min，过滤，滤液水浴蒸干后用1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。另分别称取胡芦巴碱、盐酸水苏碱各1 mg，各用1 mL甲醇溶解，作为对照品溶液。取上述各溶液适量点于硅胶G板上，以丙酮-无水乙醇-盐酸（5∶6∶1）为展开剂，展开，取出晾干后，喷稀碘化铋钾-三氯化铁（10∶1），在薄层显色加热器上加热显色，与对照品相应位置显相同颜色斑点（图3）。
2、4 检查
参照2010版《中国药典》（一部）[6]附录检测杂质检查、水分测定法（烘干法）、灰分测定法、酸不溶性灰分测定法的方法对10批药材进行检测。每批药材取3份平行样并计算其平均值（表1）。
a、 水苏碱；b、 胡芦巴碱。
图3 苜蓿子薄层色谱图
Fig、3 The TLC of Medicago sativa seeds
2、5 胡芦巴碱含量测定
2、5、1 色谱条件与系统适用性试验 参考文献[7-8]，选择氨基柱（4、6 mm×150 mm，5 μm），以乙腈-水（82∶18）为流动相，检测波长265 nm，柱温30 ℃，流速1 mL・min-1，进样量5 μL。在上述色谱条件下，胡芦巴碱与供试品中其他组分色谱峰可达到基线分离，分离度符合要求（图4）。
A、 对照品；B、样品；1、胡芦巴碱。
图4 对照品和样品的HPLC图
Fig、4 HPLC chromatograms of reference substance and samples
2、5、2 对照品溶液制备 精密称取胡芦巴碱对照品0、004 30 g，以甲醇定容于10 mL量瓶中，配制成质量浓度为0、43 g・L-1的对照品溶液，摇匀。过0、45 μm微孔滤膜，即得。
2、5、3 供试品溶液制备 精密称定不同批次的苜蓿子粉末（过2号筛）2 g，装入具塞锥形瓶中，以25 mL甲醇为溶剂，称定质量，超声提取30 min，放冷、用甲醇补足失重，过0、45 μm微孔滤膜，即得。
2、5、4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0、5，1，1、5，2，2、5 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，过0、45 μm微孔滤膜备用。分别吸取上述各浓度对照品溶液5 μL，进样，以浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，胡芦巴碱线性回归方程为Y=7 602 860、81X-4 213、02，r=0、999 7。结果表明，胡芦巴碱进样量在0、215 0～1、075 μg，峰面积与进样量呈现良好的线性关系。
2、5、5 精密度试验 取对照品溶液按上述色谱条件测定，连续进样6次。测定胡芦巴碱峰面积积分值，计算RSD为0、66%（n=6），该方法精密度良好。
2、5、6 稳定性试验 取第10批苜蓿子样品溶液为供试液，按以上色谱条件分别在0，2，4，8，10，12，24 h进样，计算胡芦巴碱含量的RSD为1、6%（n=7）。实验结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。
2、5、7 重复性试验 精密称取第8批苜蓿子药材粉末6份，按2、5、3项下方法制成供试液，并在上述色谱条件下进样5 μL，结果供试品中胡芦巴碱含量的RSD为1、5%（n=6），表明实验方法的重复性较好。
2、5、8 加样回收试验 分别精密称取6份已知含量苜蓿子药材粉末1 g，分别置于100 mL具塞锥形瓶中，精密称取胡芦巴碱对照品7、45 mg置25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度。每个具塞锥形瓶中分别准确对照品4 mL和甲醇21 mL，按2、5、3项下方法制成供试液，在上述色谱条件下进样5 μL测定，结果平均回收率为105、7 %，RSD为2、0%（n=6）（表2）。
2、5、9 样品含量测定 精密吸取供试品溶液5 μL分别注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，每批平行测定5次，计算样品中胡芦巴碱的含量，10批苜蓿子的胡芦巴碱的含量差异较小，平均质量分数为0、994 5 mg・g-1（表3）。
3 讨论
对10批苜蓿子的性状和显微特征观察结果表明，苜蓿子的性状和显微特征明显，专属性强，可作为苜蓿子鉴别的依据；根据检查项分析可得出结论，标准的制定按各平均值的±20 %作为限度的制定幅度，初步限定苜蓿子的杂质不得超过5%，水分不得超过10%，灰分不得超过6%，酸不溶性灰分不得超过2%，胡芦巴碱含量不得低于0、795 6 mg・g-1。
本实验通过对苜蓿子的生药学鉴定，各检查项的检测，系统的分析了维药苜蓿子的质量指标，暂定了苜蓿子药材质量控制指标的参考值，该质量标准可用于评价苜蓿子药材的质量，为保证苜蓿子药材临床安全、质量可控提供了基础数据。
[参考文献]
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Quality standard of uygur medicine Medicago sativa seeds
DING Wen-huan， XU Hai-yan， WANG Dong-dong， LI Jie， TIAN Shu-ge*
（Xinjiang Key Laboratory of Famous Prescription and Science of Formulas， Urumqi 830011， China）
[Abstract] In this paper， microscopic identification method was adopted to observe the microscopic characters of ten batches of Medicago sativa seeds、 And M、 sativa seeds were identificated by TLC method in contrast to trigonelline and stachydrine hydrochloride、 The impurities， moisture， ash， sour insoluble ash were detected based on Chinese Pharmacopoeia 2010 version （Vol Ⅰ）、 An HPLC method was also established for determination of trigonelline in the M、 sativa seeds、 The contents of impurities， moisture， ash， sour insoluble ash should not exceed 5%， 10%， 6%， and 2%， respectively、 The content of trigonelline should be not less than 0、795 6 mg・g-1、 The experimental methods were accurate and reliable， and can be used as the quality control of the seeds of M、 sativa、
[Key words] Medicago sativa seeds； quality standard； trigonelline
doi：10.4268/cjcmm20132136