游离脂肪酸诱导肾小管上皮细胞凋亡的实验研究

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[摘要] 目的 探讨游离脂肪酸(FFAs)对大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)的凋亡作用及凋亡机制。方法 用含有不同浓度(0、125、250、500μM)软脂酸的DMEM-F12培养肾小管上皮细胞(NRK-52E),在24h、48h两个时段以原位末端标记(TUNEL法)检测细胞凋亡率,用硝酸还原酶法测定以上各组培养液中一氧化氮(NO)水平。在48h时段用免疫细胞化学法检测caspase-3表达水平。结果 随着软脂酸浓度的增高、作用时间的延长:①NRK-52E细胞的凋亡率逐渐增高,24h时三个软脂酸组按软脂酸浓度由低到高的凋亡率依次为(9.7±1.9)%、(14.2±4.5)%、(23.4±5.3)%,48h时为(16.2±3.7)%、(24.8±4.4)%、(35.4±5.7)%,与对照组相比均有统计学意义(P

[关键词] 游离脂肪酸;近端肾小管上皮细胞;一氧化氮;凋亡;caspase-3

[中图分类号] R329.2+5[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701(2010)12-06-03

Free Fatty Acid-induced Apoptosis of Renal Tubular Epithelial Cells:An Experimental Study

LI Yuan1LIU Xiaoling2LI Rongshan2BAI Bo2HAN Le1

1. Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2. The Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

[Abstract] Objective To observe the effect and mechanism of free fatty acid(FFAs)on apoptosis of proximal renal tubular epithelial cells. Methods Rat renal tubular epithelial cells(NRK-52E) were cultured with DMEM-F12 at different concentrations of palmitic acid(0,125,250 and 500μM)at 24h and 48h,respectively. The percentage of apoptotic cells was assessed by Tunel and Nitrate reduction test was used to measure NO content of the medium. Caspase-3 expression was detected by immunocytochemistry method at 48h. Results As the palmitic acid concentration increased and the reactive time prolonged,the apoptosis rate of NRK-52E cells was gradually increased, at 24 h the apoptosis rates of the three palmitic acid groups at the concentrations of palmitic acid from low to high were(9.7±1.9)%, (14.2±4.5)% and (23.4±5.3)%, at 48h(16.2±3.7)%,(24.8±4.4)%,(35.4±5.7)% and they were significantly different from the apoptosis rate of the control group(P

[Key words] Free fatty acid;Proximal renal tubular epithelial cells;NO;Apoptosis;Caspase-3

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是高发的糖尿病慢性并发症,糖尿病终末期肾病占到所有终末期肾病的30%以上,细胞凋亡在肾脏疾病的发生、发展过程中发挥着极其重要的作用。2型糖尿病常伴血脂代谢紊乱,血清游离脂肪酸浓度随着血糖的异常发生改变,伴随空腹血糖水平的升高而升高[1]。FFA异常增多可诱导多种细胞凋亡,本实验正是观察不同浓度的软脂酸对大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡及凋亡信号蛋白caspase-3的影响,探讨FFAs导致肾小管上皮细胞凋亡的机制。

1材料和方法

1.1材料

大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)由中山大学余学清教授惠赠,软脂酸、EMDE-F12培养基购于Gibco公司,新生胎牛血清购于杭州四季青生物公司;去脂牛血清白蛋白(d-BSA);NO检测试剂盒购自南京建成公司,凋亡试剂盒、DAB显色剂、caspase-3多克隆抗体(浓度为1∶150)及生物素化羊抗兔IgG及均购自博士德公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养采用含10%胎牛血清的DMEM-F12为NRK-52E细胞的培养液,在含5%CO2浓度37℃恒温培养箱内孵育,细胞传至第四代处于生长对数期时进行下述实验,每个实验重复3次。

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1.2.2分组方法实验共设立五组(1)软脂酸干预组设三组:以去脂牛血清白蛋白(d-BSA)为溶解软脂酸的载体,以加入培养液中软脂酸浓度的不同分为125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L,(各组载体d-BSA含量为0.125%、0.25%、0.5%);(2)对照组设两组:①正常培养液组②0.5%d-BSA+正常培养液组。

1.2.3硝酸还原酶法分别测定NO常规消化、收集NRK-52E细胞,按每孔1×105接种于6孔培养板内,置37℃、5%CO2培养24h,换无血清培养液培养24h同步化细胞,加入不同浓度软脂酸继续培养,在0h、24h、48h时收集细胞培养液各100μL,-20℃储存用硝酸还原酶法测定各组NO含量。

1.2.4原位末端标记(TUNEL法)检测细胞凋亡水平按每孔1×105接种于放有盖玻片的6孔培养板内,置37℃、5%CO2孵箱细胞爬片培养24h,换无血清培养液培养24h同步化细胞后,加入不同浓度软脂酸继续培养,分别在24h、48h进行实验:先用PBS洗涤2次,加入4%多聚甲醛室温下固定30min,按照tunel凋亡检测说明书操作。再用苏木素轻度复染正常细胞,凋亡的细胞胞质浓缩、胞核固缩呈黄色,正常细胞形态正常胞核呈蓝色。从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。在400倍倒置显微镜下计数,凋亡率=凋亡细胞数/400倍视野中细胞总数×100%,每张片随机取9个视野,每个实验组观察5张片。

1.2.5免疫细胞化学法检测caspase-3按每孔1×105接种于放有盖玻片的6孔培养板内,置37℃、5%CO2孵箱细胞爬片培养24h,换无血清培养液培养24h同步化细胞后,加入不同浓度软脂酸继续培养,在48h进行实验:先用PBS洗涤2次,加入4%多聚甲醛室温下固定30min,PBS洗2次,蒸馏水洗3次,3%H2O2处理5min,蒸馏水洗3次,5%BSA封闭20min,甩去不洗加一抗4℃湿盒过夜,PBS洗3次,加二抗(生物素化羊抗兔IgG)37℃反应20min,PBS洗3次,加SABC37℃反应20min,PBS洗4次,DAB显色10~20min,苏木素轻度复染,蒸馏水洗。风干、封片。400倍倒置显微镜观察:细胞胞质成棕黄色者为阳性细胞。caspase-3表达率=阳性细胞数/400倍视野中细胞总数×100%,每张片随机取9个视野,每个实验组观察5张片。

2统计学处理

采用SPSS13.0统计软件,实验数据以均数±标准差(χ±s)表示,多个样本均数间两两比较采用单因素方差分析和q检验,两样本均数间比较行t检验。

3结果

3.1一氧化氮测定

见表1。表1显示,正常培养液组和d-BSA组培养液中NO浓度无明显升高,各软脂酸处理组在第24小时、48小时NO均明显增高,其中各软脂酸处理组与0h组相比,在第48小时表现出显著统计学差异(P

3.2TUNEL原位凋亡检测

见表2。表2显示,NRK-52E细胞在正常培养液组、d-BSA组培养,在24h、48h两个时段都有少量凋亡细胞,两对照组之间无统计学差异(P>0.05)。各软脂酸处理组细胞凋亡率明显增高,与正常培养液组和d-BSA组比较,差异均有统计学意义(P

3.3细胞免疫化学法检测

见图1。图1显示,NRK-52E细胞在正常培养液组、d-BSA组培养,48h都有少量细胞caspase-3表达,两对照组之间无统计学差异(P>0.05)。各软脂酸处理组细胞caspase-3表达率明显增高,且具有浓度依赖趋势,和48h时的细胞凋亡率基本一致,与正常培养液组和d-BSA组比较,差异均有统计学意义(P

4讨论

随着现代生活水平的提高、生活方式的改变,肥胖、高血压、高血脂、高血糖为特征的代谢综合征患病率逐年上升。脂质代谢的异常存在于上述各类疾病中[2],但以往对血脂的研究重点主要集中在心血管的损伤作用上,近年有学者报道,蛋白尿的肾毒性可能是由结合在蛋白上的脂质介导,其中游离脂肪酸(FFAs)起重要的作用[3,4]。游离脂肪酸(free fatty acids,FFAs)是指非酯化的脂肪酸(nonesterified fatty acid,NFFA),是脂肪代谢的中间产物,在血中与白蛋白结合运输,可随尿白蛋白经过肾小管,为FFAs导致肾小管细胞损害提供了基础。正常肾小管上皮细胞具有旺盛的代谢活性和修复能力,并能分泌多种细胞因子,在病理状态下,也容易发生结构、功能的损伤。莫湛宇等人发现,FFAs有促进肾小管表型转化肾小管间质纤维的作用[5]。FFA的长期作用还可诱导多种细胞凋亡,包括胰岛β细胞、血管内皮细胞、卵巢颗粒细胞[6]和Leydig细胞[7]等。

我们采用体外干预的方法,以白蛋白为载体用含不同浓度软脂酸的培养液培养大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)发现在软脂酸浓度增高和干预时间的延长时,细胞凋亡率增加,在48h测得各软脂酸干预组细胞中caspase-3阳性表达率与细胞凋亡率基本一致,而凋亡率增高组培养液中NRK-52E细胞NO的分泌量也显著增加。而d-BSA组和正常培养液组相比在对NRK-52E细胞的凋亡作用上没有差别,排除了作为FFA载体的小剂量白蛋白(

综上所述,游离脂肪酸对肾小管上皮细胞脂性凋亡作用与其自身在FFAs作用下产生大量NO有关,caspase-3作为重要的效应因子在肾小管上皮细胞凋亡过程中起重要作用。

[参考文献]

[1] 杨治芳,毛季萍,汤佳珍. 2型糖尿病患者游离脂肪酸与大血管病变的相关性研究[J]. 中华糖尿病杂志,2004,12(2):100-103.

[2] Dario A,Gutierrez BS,Michael J,et al. Impact of increased adipose tissue mass on inflammation, insulin resistance, and dyslipidemia[J]. Curr Diab Rep,2009,9(1):26-32.

[3] Atsuko Kamijo,Kenjiro Kimura. Urinary free fatty acids bound to albumin aggravate tubulointerstitial damage[J]. Kidney International,2002,62(5):1628-1637.

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[4] Yoshimichi Urahama,Yuki Ohsaki. Lipid droplet-associated proteins protect renal tubular cells from fatty acid-induced apoptosis[J]. Am J Pathol,2008,173(5):1286-1294.

[5] 莫湛宇,冯明亮,刘华峰,等. 游离脂肪酸对体外肾小管上皮细胞表型转化的影响[J]. 中华肾脏病杂志,2004,20(5):355-357.

[6] Mu YM,Yanase T,Nishi Y,et al. Saturated FFAs,palmiti-cacid and stearic acid,induce apoptosis in human granulosacells[J]. Endocrinology,2001,142(8):3590-3597.

[7] Lu ZH,Mu YM,Wang BA,et al. Saturated free fatty acids,palmitic acid and stearic acid,induce apoptosis by stimulation of ceramide generation in rat testicular Leydig cell[J]. BiochemBiophyRes Commun,2003,303(4):1002-1007.

[8] Kroncke KD, Fehsel K, Suschek C, et al. Inducible nitric oxide synthase-derived nitric oxide in gene regulation,cell death and cell survival[J]. Int Immunopharmacol,2001,1(8):1407-1420.

[9] Alao Y, Yamada H, Nakagawa Y. Arsenic-induced apoptosis in m alignant cells in vitro[J]. Leuk Lymphoma,2000,37(1-2):53-63.

[10] Anuradha CD,K anno S,Hirano S. Oxidative damage of mitochondria is a preliminary step to caspase-3 activation in fluoride-induced apoptosis in HL-60 cells[J]. Free Radic Biol Med,2001,31(3):367-373.

(收稿日期:2010-01-26)

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