垂体腺苷酸环化酶激活肽在实验性偏头痛大鼠中的作用
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摘要：目的观察尾静脉注射垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP38）大鼠的行为学变化和三叉神经核尾部（TNC）c-fos蛋白的表达，探讨PACAP38诱导偏头痛发作的可能机制。方法将30只Wistar大鼠随机分为5组：空白对照组、硝酸甘油组、PACAP38低剂量组、PACAP 38中剂量组、PACAP38高剂量组，观察大鼠行为学变化。应用免疫组织化学染色法行脑干三叉神经脊束核尾核（TNC）部位c-fos蛋白表达变化的观察。结果PACAP38中剂量组、PACAP38高剂量组大鼠均有明显的行为学改变和c-fos蛋白免疫阳性细胞数的明显增多，各项观察指标与硝酸甘油组比较无统计学意义（P>0.05），与空白对照组比较有统计学意义（P0.05）；但其他行为学改变均不明显，TNC部位c-fos蛋白免疫阳性细胞数与空白组比较无明显增加，与硝酸甘油组比较有统计与意义（P
关键词：偏头痛 垂体腺苷酸环化酶激活肽 三叉神经脊束核尾核
中图分类号：R747.2R255文献标识码：A文章编号：1672-1349(2011)05-0582-03
偏头痛是临床上常见的原发性头痛疾患，常可造成劳动力丧失。在世界卫生组织列出的世界范围内所有可造成伤残的疾病中，按危害程度偏头痛位列19位［1］。本实验通过观察尾静脉注射垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP38）后大鼠的行为学变化和大鼠三叉神经核尾核（TNC）的c-fos蛋白表达情况，与已得到公认的硝酸甘油（NTG）实验性偏头痛大鼠模型比较，探讨PACAP38能否作为诱发大鼠偏头痛发作的诱导剂，为偏头痛发病机制及治疗药物研究和开发提供实验依据。
1材料与方法
1.1实验动物Wistar系健康封闭群大鼠30只，体重（250～300）g，由山西医科大学实验动物中心提供。
1.2主要试剂及药品垂体腺苷酸环化酶激活肽（吉尔生化有限公司，批号P1009007-SY52290），兔抗大鼠c-fos抗体、SP-9001免疫组化染色试剂盒，DAB显色剂均为博士德生物工程有限公司提供，硝酸甘油注射液（太行制药有限公司，批号120101）。
1.3方法
1.3.1分组将30只大鼠随机分为硝酸甘油模型组、PACAP38高剂量组、PACAP38中剂量组、PACAP38低剂量组、空白对照组，每组6只，雌雄各半。硝酸甘油组大鼠给予尾静脉注射硝酸甘油注射液2 μg/kg，建立实验性偏头痛大鼠模型；PACAP38高、中、低剂量组大鼠分别给予尾静脉注射PACAP38 12 μg/kg、6 μg/kg、3 μg/kg；空白对照组大鼠给予尾静脉注射1 mL/kg生理盐水。
1.3.2大鼠行为学观察观察耳红、挠头、爬笼出现及消失的时间。挠头出现时间以大鼠连续挠头次数达5次以上为标志，消失时间以一个时间段中大鼠挠头次数少于5次，并出现倦怠疲乏表现为标志。采用持续时间分段计数方法，以每30 min为一时间段。
1.3.3取材及切片造模4 h后，用10%水合氯醛0.3 mL/kg麻醉动物，仰卧固定、开胸，心尖部插管入主动脉，剪开右心耳处。首先迅速灌注生理盐水200 mL，冲净血液后再以4%多聚甲醛250 mL灌注，待充分固定后断头，取脑组织，自延髓闩部向尾端行冠状切取4 mm脑组织，放入甲醛液中固定24 h，后移入70%的乙醇中保存。常规脱水、石蜡包埋。石蜡切片机切片，每次2 μm，共4张。1.3.4免疫组化石蜡切片行常规HE染色，显微镜下观察确定组织结构未被破坏，进行免疫组织化学染色。室温显色，镜下控制反应时间，（2～3）min后显色充分。蒸馏水充分洗涤。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中型树胶封固。
1.3.5免疫组化对照实验阴性对照，用PBS缓冲液代替c-fos抗体，其他步骤与前述程序相同。
1.3.6图像定量分析在光学显微镜下，切片背景为淡黄色或无色，阳性细胞呈黄褐色圆形或卵圆形，主要为核染，易与背景分别。高倍镜下每张切片在TNC部位随机选取5个视野，记录阳性细胞数，取平均值进行统计学比较。
1.4统计学处理计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 13.0统计软件分析。各组间先行方差齐性检验，在各组方差齐的情况下，采用单因素方差分析，其中两两比较用LSD-t检验。
2结果
2.1耳红空白对照组大鼠始终没有耳红症状出现，硝酸甘油组、PACAP38高剂量组、PACAP38中剂量组、PACAP38低剂量组平均在静脉给药后4 min出现耳红，各组间无统计学意义（P＞0.05);4组在给药后3 h耳红症状消失,数据记录各组间无统计学意义(P＞0.05)。详见表1。
2.2挠头硝酸甘油组、PACAP38中剂量组、PACAP38高剂量组均出现了挠头增多现象，出现与消失时间基本与耳红时间相平行（P＞0.05）。详见表2。大鼠在尾静脉给药后4 min出现挠头频繁，60 min～90 min维持高峰期，之后挠头次数逐渐下降，至180 min挠头消失。空白对照组、PACAP38低剂量组挠头次数无明显增加，与硝酸甘油组同时间段比较有统计学意义（P
2.3爬笼硝酸甘油组、PACAP38中剂量组、PACAP38高剂量组大鼠在尾静脉给药后出现明显烦躁、爬笼次数增多，增多、减少以及高峰时间与挠头时间相类似。详见表4。2.4c-fos蛋白表达光学显微镜下可见切片背景为淡黄色，c-fos免疫反应阳性神经元呈黄褐色圆形或卵圆形，核染为主，主要分布于两侧TNC。阴性对照片无阳性信号出现。硝酸甘油组、PACAP38中剂量组、PACAP38高剂量组较空白对照组c-fos免疫阳性细胞明显增多（P0.05）；PACAP38低剂量组c-fos免疫阳性细胞较空白对照组无统计学意义（P>0.05）。详见表5。
3讨论
三叉神经血管系统目前被认为是偏头痛发作的解剖结构基础，此系统的激活是患者偏头痛发作产生疼痛的关键环节。基于这一理论提出的三叉神经血管反射假说是目前解释偏头痛发病机制的主流学说之一。这一假说将血管、神经、递质三者相结合，认为偏头痛患者的三叉神经血管系统及中枢性调节系统可能存在功能。偏头痛发作启始，神经组织受刺激后颅内血管周围的神经纤维释放多种神经递质，引发包括颅内血管舒缩障碍、血浆成分外渗及肥大细胞脱颗粒致无菌性神经源性炎症以及三叉神经敏化在内的一系列病理生理改变，从而触发偏头痛的发作［2］。
PACAP38是一种具有多样生物活性的神经多肽，在中枢神经系统和周围神经系统均有广泛的表达，有神经递质和神经调质的作用。PACAP38具有高度扩血管作用，而以往研究结果提示人体静脉输注扩血管药物可能引发偏头痛发作。基于上述两点，Henrik等提出了静脉给予PACAP38注射可能诱发人体偏头痛发作的假设，并在随后的实验中得到证实，这项双盲交叉试验显示，人体在肘静脉注射PACAP38（10 mg/kg）后诱发了偏头痛样头痛发作［3］。
大鼠对疼痛的行为学反应比较复杂。付先军等［4］建立的一套比较完整的NTG偏头痛大鼠模型行为学特征评价体系中，评价指标主要包括耳红、挠头、爬笼等行为学改变，这些指标是大鼠对疼痛防御反应的客观表现，可广泛应用于大鼠偏头痛发作的评估。c-fos原癌基因是一种即早基因，它的快速表达产物c-fos蛋白被作为神经元激活的标志物广泛用于感觉通路的研究，并可用于神经元功能活动的形态定位［5］。本实验中，观察到尾静脉注射中等剂量（6 μg/kg）以上的PACAP38出现了耳红、连续挠头、爬笼增多等行为学改变，相关记录数据经统计学比较与硝酸甘油组无统计学意义（P>0.05）；同时在PACAP38中、高剂量组大鼠脑干TNC部位观察到c-fos蛋白免疫阳性细胞明显较空白组增多（P0.05）。推测低剂量PACAP38仅能引起实验动物动脉扩张而不能达到诱发偏头痛阈值。
PACAP38受体可分为两类三型即VPAC1、VPAC2、PAC1。其中VPAC1及VPAC2与血管活性肠肽（VIP）和PACAP38的亲合力相当，而PAC1与PACAP38的亲和力要远远高于VIP［6］。目前并无明确证据表明究竟是哪型受体介导偏头痛发作，且无任一PACAP38受体拮抗剂阻止偏头痛发作的相关实验研究。但根据VIP只能诱导人体较弱头痛而非偏头痛样头痛发作［7］，高度提示PAC1受体可能是PACAP38介导偏头痛发作的作用靶点。
PACAP38介导偏头痛发作的病理生理过程尚不明确。尽管PACAP38具有高强度的扩血管作用，但在本实验中显示PACAP38低剂量组大鼠仅有耳红症状出现，耳红程度以及出现、消失时间与除空白组外其余3组无统计学意义，但其他行为学改变并不明显，且c-fos免疫阳性细胞无明显增加。扩张血管并不是PACAP38诱发偏头痛发作的决定因素。PACAP38诱导偏头痛发作的可能途径是三叉神经二级神经元敏化-致敏三叉神经-级神经元-诱发偏头痛［8］。静脉注射PACAP38 5 min后只有其中的0.063%可以通过血脑屏障［9］，推测PACAP38诱导偏头痛发作主要依靠血脑屏障外作用。静脉注射PACAP38致硬脑膜细胞内cAMP浓度的提高，可能是偏头痛发作的关键，这在具有同样效应的西洛他唑和CGRP相关研究中也得到了证实［10,11］。矛盾的是，肥大细胞脱颗粒、无菌性神经源性炎症这些很多认为的偏头痛发作关键途径所通过的受体均非PAC1而是VPAC。
在本实验中，尾静脉注射中等以上剂量的PACAP38大鼠出现了偏头痛发作的行为学及病理生理改变，提示PACAP38构建新的偏头痛大鼠实验模型的可能性。在未来的研究中,PAC1可能会成为开发偏头痛治疗药物的新的突破点，而对这一受体介导的一系列偏头痛病理生理过程的阐述，以及PAC1受体拮抗剂的研究及应用都可能对防治偏头痛发作具有重要的意义。
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作者简介：程娜（1984―），女，毕业于长治医学院，现为山西医科大学第一医院神经内科在读硕士研究生（邮编：030001）；牛争平（通讯作者），工作于山西医科大学第一医院（邮编：030001）。
（收稿日期：2011-01-18）