高效液相色谱法测定心血宁片中葛根素的含量

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摘 要：目的：建立心血宁片中葛根素的含量测定方法。方法：高效液相色谱法(HPLC)。色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18(4．6mm×150mm，5μm)；流动相：甲醇-水-磷酸(23∶77∶0.2)；检测波长：250nm；流速：1．0mL•min-1；柱温：25℃。结果：葛根素在25．05～250．5ng范围内线性关系良好，回归方程为Y＝4.458×103X(r＝0．9998)，平均加样回收率为99．44％，RSD=2．0％（n=5)。结论：本方法操作简便、准确快速、重现性好，可用于心血宁片的质量控制。

关键词：心血宁片；葛根素；高效液相色谱法；含量测定中图分类号：R284.2文献标识码：B

文章编号：1673-7717(2008)11-2515-03

Quantitative Determination of Puerarin in XinXuening Tablets by HPLC

ZHANG Chunxia,ZHOU Aizhen,advisor:YIN Hua

(College of Pharmacy,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,Zhejiang,China)

Abstract:Objective：To establish an HPLC method to determinate the content of puerarin in Xinxuening tablets．Methods:HPLC：The analysis was carried on acolumn of zorbax eclipse XDB-C18(4.6mm×150mm，5μm)at 25℃；methanol-water-H3PO4(23∶77∶0．2)as mobile phase；the flow rate was 1．0mL•min-1：the detection wavelength was 250nm．Results：A good linearity can be found in the range of 25．05~250．5ng．The average recovery rate was 99．44％，RSD：2．0％(n=5)．Conclusion：The method is simple，rapid，accurate and reliable．Itcan be used to control the quality of Xinxuening tablets．

Key words:Xinxuening tablets；puerarin；HPLC；quantitative determination

心血宁片为临床常用中成药，由葛根、山楂提取物制成，具有活血化瘀、通络止痛之功效，用于心血瘀阻、瘀阻脑络引起的胸痹、眩晕，以及冠心病、高血压、高血脂等症[1]。葛根为其君药，现代药理研究表明葛根具有扩张冠状动脉、增加冠状血流量的作用，其主要有效成分为葛根素、5，7，4’-三羟基异黄酮、大豆苷等黄酮类成分[2-3]。为了有效控制心血宁片的制剂质量，本文建立了心血宁片中葛根素的高效液相色谱含量测定方法，该方法操作简便，结果可靠，重现性好，可用于心血宁片的质量控制。

1 仪器与试剂

仪器：Agilent 1100 Series高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；十万分之一电子分析天平(德国塞多利斯)；KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；PL5124型纯水机；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；PHS-3TC(0．01级)精密数显酸度计(上海天达仪器有限公司)。药品和试剂：葛根素对照品(中国药品生物制品鉴定所，供含量测定用，批号：752-200110)；甲醇(色谱纯，MERCK公司)；水为过0．2μm滤膜的重蒸水；其余试剂均为分析纯。心血宁片(批号：031101，040322，050103)。

2 方法与结果

2．1 色谱条件及系统适应性试验

色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18(4．6mm×150 mm，5μm)；流动相：甲醇-水-磷酸(23∶77∶0．2)；检测波长：250nm；流速：1．0mL•min-1；进样量5μL。本实验条件下，葛根素与相邻组分分离完全(R≥1．5)，理论塔板数以葛根素峰计不低于4000。

2．2 样品制备

2．2．1 对照品溶液的制备

精密称取葛根素对照品10．02mg置于50mL量瓶中，加30％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为0．2004mg•mL-1的葛根素对照品储备溶液；精密吸取此储备液1．25mL置于5mL量瓶中，用30％乙醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为50．10μg•mL-1的葛根素对照品溶液。

2．2．2 供试品溶液的制备

取干燥至恒重的心血宁片内容物约0．1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇溶液25mL，称定重量，60℃超声提取20min，冷却至室温后，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液1mL至25mL量瓶中，以30%乙醇溶液稀释至刻度，用0．45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2．2．3 缺葛根阴性对照溶液的制备

按处方比例称取除葛根的其他药味，依照心血宁片的制备工艺制成缺葛根的心血宁阴性样品，再按供试品溶液的制备方法制成缺葛根的阴性对照溶液。

2.3 空白试验

取对照品溶液、供试品溶液及缺葛根的阴性对照溶液各5μL在上述色谱条件下分别进样，得到相应的色谱图(图1-A、B、C)。结果表明：葛根素对照品溶液和心血宁供试品溶液的色谱图中均在保留时间为9．3min处出现葛根素的色谱峰；而缺葛根的阴性对照溶液色谱图在此保留时间处无色谱峰，说明制剂中其他成分对葛根素测定不产生干扰。见图1。

精密吸取50．10μg•mL-1葛根素对照品溶液0．2、0.4、0．8、1．6、2mL，分别置于2mL量瓶中，用30％乙醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为5．01、10．02、20．04、40．08、50．1μg•mL-1的葛根素对照品溶液，在上述色谱条件下，分别进样5μL进行测定，以葛根素对照品的进样量X(ng)为横坐标，葛根素峰面积积分值Y为纵坐标进行线性回归，回归方程为：Y=4．458×103X(r=0．9998)，表明葛根素在25．05～250．5ng范围内进样量与峰面积之间呈良好的线性关系。

2．5 精密度试验

精密吸取20．04μg•mL-1葛根素对照品溶液在上述色谱条件下重复进样6次，每次5μL，葛根素峰面积的RSD为0．65％，表明精密度良好。

2．6 稳定性实验

取新配制的心血宁供试品溶液(批号为031101)，于0、2、4、6、8、12、24h分别进样5μL测定峰面积，结果供试品溶液葛根素峰面积的RSD为0．23％，表明心血宁供试品溶液在24h内稳定。

2．7 重复性试验

取同1批次已测含量的心血宁片内容物(批号031101)5份，每份约0．1g，精密称定，按“2．2．2供试品溶液的制备”项下方法制备供试液，并在上述色谱条件下进行测定。结果样品中葛根素的平均含量为82.25mg•g-1RSD为1.2％，表明重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已测含量的心血宁片内容物（批号031101）5份，每份约0.05g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入1.012mg•mL-1葛根素储备液4.00mL，加30％乙醇溶液21mL，按“2.2.2供试品溶液的制备”项下方法制备供试液，并在上述色谱条件下进行测定，计算加样回收率，心血宁片中葛根素的加样回收率在97.92％～102.6％间，平均回收率为99.44％，RSD2.0％。见表1。

2.9 样品含量测定

取3个批号的心血宁片内容物，每批各3份，每份约0.1g，精密称定，按“2.2.2供试品溶液的制备”项下方法制备供试液，并在上述色谱条件下进行测定，计算样品中葛根素的含量，结果见表2。

3 讨 论

3.1 样品前处理工艺的考察

3.1.1 提取溶剂的选择 根据有关文献[4-6]，不同的溶剂提取会影响样品中葛根素的提取率。因此，本实验分别采用30％乙醇和甲醇为提取溶剂，考察提取溶剂对样品中葛根素提取率的影响，结果显示两种提取溶剂对葛根素提取率相近，但考虑乙醇毒性较小，故选用30％乙醇溶液作为提取溶剂。

3．1．2 提取方法和提取时间的确定

本实验对加热回流和60℃超声提取两种提取方法进行了比较，结果显示这两种提取方法所制备的供试液中葛根素的含量相近，但考虑超声提取法操作简便，杂质少，且提取时间短，故本实验采用超声提取法制备样品。同时还考察了不同提取时间(20、30、40min)的对测定结果的影响，结果显示提取时间对心血宁片中葛根素含量的影响没有明显的差别。为了节省提取时间和减少能耗，本实验选择超声提取20min处理样品。

3．2 流动相的确定

HPLC法测定葛根素流动相大多选择甲醇-水体系[4-6]。本文分别试验了甲醇-水-磷酸(20∶80∶0．1)、甲醇-水-磷酸(23∶77∶0．1)、甲醇-水-磷酸(23∶77∶0．2)、甲醇-水-磷酸(23∶77∶0．5)等不同配比，结果以甲醇-水-磷酸(23∶77∶0．2)为流动相时，峰形较好，样品中葛根素的分离度、理论塔板数、拖尾因子均符合要求，故本文选择甲醇-水-磷酸(23∶77∶0．2)为流动相。

3．3 制剂质量

本文所测的3批不同批号心血宁片，其葛根素的含量差异较大。从而提示为保证心血宁片的制剂质量，首先要控制原药材的质量。

4 结 论

本文采用紫外检测器，以Zorbax Eclipse XDB-C18为色谱柱，甲醇-水-磷酸(23∶77∶0.2)为流动相，建立了心血宁片中葛根素的高效液相色谱含量测定方法，该法操作简便，结果可靠，重现性好，可用于心血宁片的质量控制。

参考文献

［1］ 林启光.心血宁片治疗冠心病186例临床疗效观察[J].中成药，1994，16（7）：25-26.

［2］ 王靖，吉民，华维一，等.葛根素研究进展[J].药学进展，2003（2）：176.

［3］ 姜静岩，何燕，巩密密.葛根素的药理及临床应用[J].现代中西医结合杂志，2004（21）：869.

［4］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典•Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：233-234.

［5］ 路玫，韦戈，黄雪梅，等.反相高效液相色谱法测定心安宁片中葛根素的含量[J].中国现代应用药学，2003，20（4）：305-306.

［6］ 石天松.高效液相色谱法测定葛根素注射液的含量[J].中国药师，2004，7（8）：623.