植物抗病WRKY转录因子生物信息学分析
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摘要：以GenBank上登录的拟南芥（Arabidopsis thaliana）、欧芹（Petroselinum crispum）、辣椒（Capsicum annuum L.）、水稻（Oryza sativa L.）和毛白杨（Populus tomentosa）的22个WRKY家族抗病转录因子为分析对象，采用生物信息学方法对其系统发生树、保守基序和蛋白质三级结构进行分析。结果表明，22个抗病WRKY转录因子分为2个大类群，7个亚类群。两大类群的转录因子都具有基序1和2，系统发育树中第一大类群中的拟南芥AtWRKY4和AtWRKY25，欧芹PcWRKY1和辣椒CaWRKY-a具有相似的蛋白质三级结构，其都具有基序9和基序12，拟南芥AtWRKY33和AtWRKY48具有相似的蛋白质三级结构，都具有基序18；系统发育树中第四亚类群中的辣椒CaWRKY1和毛白杨PtWRKY23，具有相似的蛋白质三级结构。
中图分类号：S718.46；Q7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1191-05
植物在长期进化过程中形成了一系列机制，以适应和抵御各种生物和非生物逆境，在众多的适应性机制中，基因表达的转录调节在植物应答环境信号刺激反应过程中起着重要作用。转录因子是植物中最重要的一类调节基因。wrky是近年来新发现的植物特有的新型锌指型转录调控因子， 是一类植物特有的转录因子家族，因在其N-端含有由WRKYGQK组成的高度保守的7个氨基酸序列而得名，WRKY基因首先被克隆于甘薯[1]，随后在约20多种植物中证实存在WRKY蛋白，并阐明了相应的分子生物学功能[2]，WRKY家族转录因子主要与植物的抗逆性和衰老等生理过程有关。病原菌、伤害和植物激素类物质等多种外界因素均能诱导WRKY基因的表达[3]。本研究以GenBank上登录的拟南芥（Arabidopsis thaliana）、欧芹（Petroselinum crispum）、辣椒（Capsicum annuum L.）、水稻（Oryza sativa L.）和毛白杨（Populus tomentosa）5个物种的22个WRKY家族抗病转录因子为材料，利用生物信息学方法研究该转录因子编码区的变异，为其他植物WRKY抗病基因克隆及其研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
数据资料来源于美国国立生物技术信息中心NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）核苷酸数据库和国家水稻数据中心（http：///），其中拟南芥有13种，AtWRKY40 NM_106732、 AtWRKY60 NM_128058、 AtWRKY48 NM_124329、AtWRKY25 NM_128578，对丁香假单胞菌起负调控作用[4-6]；AtWRKY18NM_119329的中度水平表达会引起PR基因表达及对丁香假单胞菌的抗性增强[7]；AtWRKY41 NM_117177具有双重调控作用，能够抵抗细菌和真菌病原物的重要下游基因的产物，抗丁香假单胞菌[8]；AtWRKY70 NM_115498，参与两条抗性信号转导途径的调控交叉点，即通过激活SA介导的抗病信号转导途径，同时又抑制JA介导的抗病信号转导，调控拟南芥的抗病反应，主要对丁香假单胞菌起抗病作用[9]；AtWRKY33 NM_129404作为JA/ET介导途径中的正调控子，在抗真菌病原菌方面发挥作用，如防治灰霉病[10]；AtWRKY3 NM_126385对抗腐生病原菌起正调控作用；AtWRKY4 AF425835可以抗青枯病与腐生病原菌，超表达时对假单胞菌有毒小种的抗性增强， 对软腐病菌抗性减弱[11]；AtWRKY29 NM_118486是MAPK通路中可作为典型的WRKY基因参与拟南芥植株的抗病信号的转导[12]；AtWRKY6 NM_104910可以抗细菌、病毒、卵菌和真菌[13]；AtWRKY27 AF418310抗青枯病[14]。辣椒有3种，CaWRKY-a AY391747抗烟草花叶病毒[15]；CaWRKY2 DQ402421抗丁香假单胞菌[16]；CaWRKY1 AY229992通过负调控作用抗病菌[17]。欧芹3种，PcWRKY4 AF204925、PcWRKY5 AF204926均为抗大豆疫霉菌的激发子[18]；PcWRKY1 PCU48831抗大豆疫霉菌[19]。毛白杨有1种，PtWRKY23 EF051079抗叶锈病[20]。水稻2种，OsWRKY71 AB190817参与赤霉素信号传导，脱落酸介导的信号传导，依赖于R基因的防卫反应信号途径，抗白叶枯病；OsWRKY13 EF143611参与茉莉酸介导的信号传导、水杨酸介导的信号途径，抗白叶枯病和稻瘟病。
1.2 转录因子系统发育树的构建
利用Maga 5.0软件对NCBI数据库中搜索到的对病原菌有调控作用的转录因子和基因全长序列进行系统进化树的构建。采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，对生成的系统发育树进行Bootstrap校正，得到最终的系统发育树。
1.3 转录因子保守基序的分析
利用在线MEME 4.8.0软件（http：//meme.sdsc.edu）对转录因子的氨基酸序列进行保守基序分析。
1.4 转录因子编码蛋白质的三级结构分析
利用在线CPHmodels工具对9种蛋白质进行同源建模，并利用高级结构预测软件RasMol对各转录因子和基因编码的蛋白质三维结构进行分析。
2 结果与分析
2.1 不同植物抗病WRKY转录因子系统发育树的构建
对22个WRKY家族抗病转录因子进行系统发育树构建，结果（图1）表明，可以将这22个抗病WRKY转录因子分为2大类群，7个亚类群。第一大类群中的欧芹PcWRKY1，辣椒CaWRKY-a、CaWRKY2，拟南芥AtWRKY4、AtWRKY3、AtWRKY25、AtWRKY33都含有两个WRKY结构域。拟南芥WRKY抗病转录因子中对腐生病原菌起正调控作用的为AtWRKY3和AtWRKY4，二者抗腐生病原菌，起正调控作用[12]。
欧芹PcWRKY1对大豆疫霉菌有抗性作用[19]，拟南芥AtWRKY33对灰霉病起抗性作用[11]，而辣椒CaWRKY-a对烟草花叶病毒起抗性作用。从系统发生树（图1）上可以看出，这3个转录因子组成第一个亚类群，其中拟南芥AtWRKY33与辣椒CaWRKY-a亲缘性相近，而与欧芹PcWRKY1的亲缘性次之，但目前的研究表明其在抗病原理上并不相同，有待进一步研究。
拟南芥AtWRKY25和辣椒CaWRKY2聚为第二亚类群，二者均对丁香假单胞菌起调控作用；拟南芥AtWRKY3和AtWRKY4聚为第三亚类群，二者均对腐生病原菌起调控作用。
拟南芥AtWRKY48、毛白杨PtWRKY23和辣椒CaWRKY1聚为第四亚类群。研究表明，拟南芥AtWRKY48对丁香假单胞菌起负调控作用[5]，辣椒CaWRKY1对丁香假单胞菌、烟草花叶病毒等起负调控作用[17]，毛白杨PtWRKY23对叶锈病起抗性作用。
拟南芥AtWRKY6、AtWRKY18、AtWRKY60、AtWRKY40，水稻OsWRKY71和欧芹PcWRKY4聚为第五亚类群，其中对细菌、真菌、卵菌、病毒起抗性作用的拟南芥AtWRKY6[13]单独成一类，拟南芥AtWRKY18、AtWRKY60和AtWRKY40均对假单胞菌有抗性作用[4，7]，而拟南芥AtWRKY18和水稻OsWRKY71均会引起R基因表达抗病，且都是通过SA代谢途径起到抗病作用[4]，而欧芹PcWRKY4为抗大豆疫霉菌因子。
拟南芥AtWRKY27、AtWRKY29和水稻OsWRKY13聚为第六亚类群。在抗病方面，拟南芥AtWRKY27抗青枯病，AtWRKY29是MAPK通路中能够抵抗细菌和真菌病原物的重要下游基因的产物，水稻OsWRKY13参与茉莉酸介导的信号传导、 水杨酸介导的信号途径，抗白叶枯病和稻瘟病。
拟南芥AtWRKY41、AtWRKY70与欧芹PcWRKY5聚为第七亚类群。研究表明，它们均属于锌指结构C2-HC（C-X7-C-X23-H-X1-C）型[21]，其中拟南芥AtWRKY41与AtWRKY70均对细菌具有抗病性，但抗病途径并不相同[8，10]，而欧芹PcWRKY5对大豆疫霉菌因子有抗性，它们在抗病方面并不完全相同。
2.2 不同植物抗病WRKY转录因子保守基序的分析
由图2可知，22个抗病的WRKY转录因子都具有保守基序1和2，部分WRKY转录因子之间也有共性。系统发育树中第一大类群的1、2、3亚类群中的欧芹PcWRKY1，辣椒CaWRKY-a、CaWRKY2，拟南芥AtWRKY4、AtWRKY3、AtWRKY25和AtWRKY33都具有基序9和基序12，而第一大类群的其他亚类群和第二大类群的其他 WRKY转录因子都不具有基序9和基序12。
第五亚类群的拟南芥AtWRKY6、AtWRKY18、AtWRKY60和AtWRKY40，水稻OsWRKY71，欧芹PcWRKY4都具有基序5和基序6，而第一大类群的其他亚类群和第二大类群的其他WRKY转录因子都不具有基序5和基序6。第四亚类群中辣椒CaWRKY1和毛白杨PtWRKY23特有的基序为基序18。第七亚类群的拟南芥AtWRKY41和AtWRKY70，欧芹PcWRKY5都具有基序17。研究表明，拟南芥AtWRKY18和水稻OsWRKY71通过水杨酸代谢途径抗病[4]，基序分析表明，二者共有基序1、2、4、5、6和14。拟南芥WRKY转录因子中对腐生病原菌抗性起正调控作用的AtWRKY4和AtWRKY3都具有基序11和基序10。许多拟南芥WRKY转录因子作为防卫信号的负调控因子起作用， 如AtWRKY18、AtWRKY25、AtWRKY27、AtWRKY40、AtWRKY41、AtWRKY48和AtWRKY 60，这些WRKY转录因子都具有基序1、2、6和5。拟南芥AtWRKY70编码的蛋白质参与两条抗性信号转导途径，一是通过激活SA介导的抗病信号转导途径，二是抑制JA介导的抗病信号转导途径，从而调控拟南芥的抗病反应[10]，其仅有基序1、2、19和20。
2.3 不同植物抗病转录因子编码蛋白质的三级结构分析
高级结构决定蛋白质生物学功能，对蛋白质高级结构的预测和分析，有助于理解蛋白质结构与功能之间的相关性[22]。由图3可知，拟南芥AtWRKY4和AtWRKY25转录因子编码的蛋白质三级结构相似，均属于抗细菌型转录因子[6，12]。欧芹PcWRKY1和辣椒CaWRKY-a转录因子编码的蛋白质三级结构相似，辣椒CaWRKY-a对烟草花叶病毒具有抗性作用，而欧芹PcWRKY1对大豆疫霉菌有抗性作用。水稻OsWRKY13、欧芹PcWRKY4和PcWRKY5、拟南芥AtWRKY18和AtWRKY40编码的蛋白质三级结构相似。辣椒CaWRKY1和毛白杨PtWRKY23，拟南芥AtWRKY48和AtWRKY33编码的蛋白质三级结构相似，但其功能不尽相同[5，10]，有待进一步研究。研究表明，拟南芥AtWRKY18和AtWRKY6，欧芹PcWRKY1以及水稻OsWRKY13的C末端结构域可与（T）（T）TGAC（C/T）序列（W-box）相结合，产生特异性作用，参与植物防卫反应作用[23，24]。
3 小结
通过对22个抗病WRKY家族转录因子进行系统发生树、基序以及蛋白质三级结构分析，得出22个抗病WRKY转录因子分为2个大类群，7个亚类群。第一大类群由欧芹PcWRKY1、PcWRKY4，辣椒CaWRKY1、 CaWRKY-a、 CaWRKY2，拟南芥AtWRKY4、 AtWRKY3、 AtWRKY25、 AtWRKY33、AtWRKY48、AtWRKY6、AtWRKY18、AtWRKY60和AtWRKY40，毛白杨PtWRKY23，水稻OsWRKY71组成。拟南芥AtWRKY41、AtWRKY70、AtWRKY27和AtWRKY29，欧芹PcWRKY5，水稻OsWRKY13组成第二大类群。22个转录因子都具有基序1和2，系统发育树中第一大类群中的拟南芥AtWRKY4和AtWRKY25，欧芹PcWRKY1和辣椒CaWRKY-a具有相似的蛋白质三级结构，都具有基序9和基序12，拟南芥AtWRKY33和AtWRKY48具有相似的蛋白质三级结构，都具有基序18；系统发育树中第四亚类群中的辣椒CaWRKY1和毛白杨PtWRKY23具有相似的蛋白质三级结构。
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