30例结肠癌患者外周血血管紧张素转换酶基因多态性检测
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【摘要】目的:研究结肠癌患者外周血血管紧张素转换酶(ACE)基因多态性分布规律。方法:30例患者为研究组,30例正常人为对照组,采用聚合酶链反应(PCR),对入组的结肠癌患者外周血中ACE基因表达进行检测,以了解ACE基因插入型(ID型)、缺失型(DD型)和Ⅱ型3种基因型及I/D等位基因在结肠癌患者外周血中的分布规律,并进行统计学处理。结果:结肠癌患者外周血ACE基因插入/缺失(I/D)多态性分布:ID型、DD型和Ⅱ型3种基因型的占比分别为36.67%、6.67%、56.66%,I/D等位基因分布频率分别为53.30%和46.70%,对照组ID型、DD型和Ⅱ型3种基因型的占比分别为53.33%、16.67%、30.00%,I/D等位基因分布频率分别为43.33%和56.67%,两组间基因型分布频率和I/D等位基因分布频率均有显著差异(p
【中图分类号】R735.3+5【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)16-099-2
血管紧张素转换酶(angiotensin Ⅰ-converting enzyme,ACE)是高血压病和肾病等研究的热点基因。近年来,结肠癌与ACE基因的关系受到重视,欧洲一项临床研究显示,ACE抑制剂(ACEI)能明显降低结肠癌风险,提示ACE与结肠癌发病可能存在一定关系[1]。有鉴于此,我们开展了本研究,观察结肠癌患者ACE基因多态性,试图了解示ACE基因与结肠癌发病之间的关系。
ACE基因位于17号染色体长臂q23位点,长度为21kb,其第16内含子存在一段287bp的DNA序列的插入(insertion,I)或缺失(deletion,D),构成ACE基因I/D多态性,ACE基因可分出I等位基因和D等位基因,并可划分出三种基因型:缺失纯合子型(DD型)、缺失与插入纯合子型(ID型)、插入纯合子型(Ⅱ型)[2-3]。对ACE等位基因及基因型的多态性研究有可能揭示两者之间的关系,从而对ACEI用于结肠癌的治疗提供理论依据。迄今,有关ACE基因与结肠癌关系的论著甚少,且结论有相互矛盾的地方,因此,本研究的开展,对于揭示ACE基因多态性与结肠癌发病之间的关系,具有一定的理论意义。
本文检测30例结肠癌患者外周血中ACE基因DD型、ID型和Ⅱ型3种基因型和I、D等位基因的分布频率,并与30例正常人外周血ACE基因分布进行比较,现将结果报告如下。
1材料与方法
1.1病例入选标准共30例,符合下列纳入标准和排除标准:①临床确诊结肠癌患者;②所有病例须有病理报告证实;③年龄40-70周岁;排除标准:①不符合结肠癌诊断标准者;②未取得病理报告证实者;③年龄70岁者;④原发性高血压病患者;⑤合并严重心、脑、肾、血液系统疾病患者;⑥精神病患者;⑦不愿意接受本研究措施者。
1.2患者情况年龄40-70周岁,其中男性18例,女性12例,临床分期Ⅰ-Ⅱ期者17例,Ⅲ-Ⅳ期者13例,结肠腺癌1例,结肠中分化腺癌10例,结肠中低分化腺癌3例,结肠状腺癌2例,结肠溃疡性中分化腺癌2例,结肠粘膜浸润性腺癌1例,结肠中分化粘液腺癌1例,结肠低分化腺癌2例,结肠管状腺癌2例,结肠中分化管状腺癌6例。研究组与对照组除结肠癌外,在一般情况方面比较均无显著差异(p>0.05)。
1.3DNA提取采用蛋白酶K消化酚-氯仿抽提法。
1.4引物合成和PCR扩增引物由上海生工合成,序列如下:
ACE-Ⅰ-upper:5'-GCCCTGCAGGTGTCTGCAGCATGT-3'
ACE-Ⅰ-down:5'-GGATGGCTCTCCCCGCCTTGTCTC-3'
扩增片段大小,插入型为597bp,缺失型为319bp。PCR扩增体系体积为25µl,反应体系含Taq酶1.0µl,10×buffer2.5µl,10mMdNTP0.5µl,引物(10pmol/µl)各0.5µl,模板gDNA约100ng。扩增条件:94℃预变性5分钟,然后94℃30”,56℃45”,72℃1分钟,共35个循环;最后72℃5分钟。试剂均购自Takara公司。对于基因型为缺失型纯合子(DD)型的个体再用特异性扩增插入片段的ACE-Ⅱ进行验证,如扩增出目的片段则为ID型。ACE-Ⅱ引物序列如下:
ACE-Ⅱ-upper:5'-TGGGACCACAGCGCCCGCCACTAC-3'
ACE-Ⅱ-down:5'-TCGCCAGCCCTCCCATGCCCATAA-3'
扩增片段大小为335bp,退火温度为65℃,反应条件同ACE-Ⅰ。
1.5PCR产物检测PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳约30分钟,电压100v,在紫外灯下观察条带。Marker为DL2000。
1.6统计学处理采用SPSS12.0统计软件,组间频率比较采用X2检验,以p
2结果
2.1PCR产物电泳结果
各标本取10µl产物加样,电泳,按常规摄片,因:ACEI/D多态性PCR检测结果。319bp片段(D等位基因)的表达及319bp和579bp片段(I等位基因)的同时表达表示ACE基因的DD,ID和Ⅱ几种基因型。M:标准对照;4,7,22,25和29:DD纯合子;1,3,8,10,11,13,14和17:ID杂合子;2,5,6,9,12和15:Ⅱ纯合子。
2.2基因型分析
ACE基因型的分布结果,研究组11例标本为缺失杂合子(ID型),占比36.67%(11/30);2例标本为缺失纯合子(DD型),占比6.67%(2/30);17例标本为插入纯合子(II型),占比56.66%(17/30);对照组:ID型、D型、II型的占比分别为53.33%、16.67%、30.00%,经统计分析,两组患者在ID型、DD型、II型基因的分布频率上有显著差异(X2=4.410,p
结肠癌患者ACE等位基因检测结果,结肠癌患者组D和I等位基因的分布频率分别为43.33%和56.67%,正常对照组分别为70.00%和30.00%,结肠癌患者和正常人外周血ACED和I等位基因存在显著差异(X2=4.344,p=0.037)。我们还对ACE基因多态性和I/D等位基因进行了亚组分析,由于样本数量的原因,在性别、病理类型、临床分期、吸烟史及家族史等因素均未表现出对ACE基因表达的影响。
3讨论
血管紧张素转换酶-Ⅰ(ACE-Ⅰ)在生理情况下通过肾素-血管紧张素系统(RAS)导致血管收缩和血压升高,并具有影响肿瘤细胞增殖、游走、新生血管生成和远处转移等生物学行为[4]。此外,还可能通过在细胞周期中诱导或调节基因表达而发挥致癌因素作用,在体实验表明AngⅡ受体拮抗剂能有效抑制转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGFβ1)依赖性肿瘤的生长。
Eleftherios氏于2007年报道,ACE基因I/D多态性通过影响ACE基因表达而与口腔癌的发病相关[5]。但ACE基因与结肠癌关系的研究尚无定论,因此本研究具有一定的新意。结果表明结肠癌患者外周血与正常人ID、DD及Ⅱ型基因频率的分布有显著性差异,Ⅱ型基因频率显著高于对照组(p
参考文献
[1] Christian JB,Lapane KL,Hume AL,et al. Association of ACE inhibitors and angiotensin receptor blockers with keratinocyte cancer prevention in the randomized VATTC trial[J].J Natl Cancer Inst,2008.