海参糖胺聚糖抗胰岛素抵抗作用的实验

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇海参糖胺聚糖抗胰岛素抵抗作用的实验范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

【摘要】目的探讨海参糖胺聚糖（HGAG）对高血糖小鼠的降糖作用及其对胰岛素抵抗（IR）HepG2细胞糖脂代谢的改善作用。方法采用静脉注射四氧嘧啶（50mg/kg）致小鼠高血糖模型，给予HGAG后，测定小鼠空腹血糖及进行糖耐量试验并计算血糖浓度-时间曲线下面积。以高浓度胰岛素持续刺激HepG2细胞建立IR-HepG2细胞模型，给予HGAG后，分别采用葡萄糖氧化酶法和GPO-POD酶法检测培养液中葡萄糖和甘油的含量，计算葡萄糖消耗量及甘油消耗量。应用MTT法监测细胞存活率。结果与高血糖模型组相比，给予HGAG可明显降低高血糖小鼠空腹血糖及糖耐量试验曲线下面积，并呈剂量依赖性。与IR-HepG2模型组相比，HGAG可明显增加IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量和甘油含量，并呈剂量依赖性。而细胞存活率无显著变化。结论HGAG具有降低高血糖小鼠血糖作用及改善IR-HepG2细胞糖脂代谢的作用。

【关键词】海参糖胺聚糖；HepG2细胞；胰岛素抵抗；葡萄糖；甘油

糖尿病是影响人类健康的常见病、多发病，研制有效的药物及保健产品以纠正糖代谢紊乱对延缓糖尿病并发症发生、改善患者生活质量及延长生命非常重要。胰岛素抵抗（InsulinResistance，IR）是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感性下降，即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态。目前认为，IR不仅是Ⅱ型糖尿病的发病基础，更是贯穿多种代谢相关疾病的主线，是连结它们的纽带，为这些疾病的共同病理生理基础［1-3］。本研究旨在初步探讨海参糖胺聚糖（holothurianglycosaminoglycan，HGAG）的降血糖作用及改善胰岛素抵抗作用。

1材料

1.1动物雄性昆明种小鼠，18-22g，清洁级，由大连医科大学提供，辽实动质字［2000］028号。

1.2试剂及药品四氧嘧啶（sigma公司），二甲双胍（天津中新药业），HGAG（海晏堂生物有限公司技术部），实验时以生理盐水稀释至所需浓度，现用现配。MEM培养液（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青血清厂），0.25%胰酶、MTT（Sigma公司），胰岛素（Ins）注射液（江苏万邦生化医药股份有限公司），葡萄糖试剂盒、甘油含量测定试剂盒（均购自南京建成生物工程研究所），蒽酮（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），硫脲（分析纯，天津市凯信化学工业有限公司）。

1.3仪器德国罗氏优越Ⅳ型血糖仪及血糖测定试纸（德国罗氏公司），双圈牌MA240D电子秤（上海第二天平仪器厂），TDZ-5WS多管架自动平衡离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），CO2细胞培养箱（美国ThermoForma），TE2000U倒置相差显微镜（日本Nikon），超净台（上海索谱仪器有限公司），酶标仪（美国Thermo354）。

1.4细胞株人肝癌细胞株HepG2由中国医学科学院协和细胞中心提供，接种于含10%体积分数胎牛血清的DMEM培养基中（补充青霉素、链霉素各100UL-1），置于37℃含有5%CO2的细胞培养箱中培养。HepG2细胞呈贴壁生长，采用0.25%胰酶进行消化，每3d传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。

2方法

2.1HGAG对四氧嘧啶致实验性高血糖小鼠空腹血糖的影响

2.1.1小鼠高血糖模型建立取雄性，18-22g昆明种小鼠，随机取其中10只为正常对照组。其余按文献方法，略有修改复制高血糖小鼠模型［4-6］：小鼠于禁食（不禁水）16h后，经尾静脉注射四氧嘧啶50mg/kg，稳定15d后测定小鼠空腹5h的血糖值（FBG），FBG>10mmol/L的小鼠即为高血糖模型小鼠。

2.1.2动物分组及给药如2.1.1项下所述，正常对照组小鼠10只。取高血糖小鼠40只，随机分为高血糖模型组、HGAG高（50mg/kg）、低（25mg/kg）剂量组和阳性对照药二甲双胍200mg/kg组。小鼠分别灌胃给予不同受试药物，正常对照组和高血糖模型组小鼠灌胃给予等容量（0.2mL/10gBW）生理盐水。各组小鼠均每日给药2次（b.i.d.），连续给药4W。

2.1.3FBG测定以德国罗氏优越Ⅳ型血糖仪测定各组小鼠给药第7、14、21和28天空腹5h的血糖值（FBG），并记录小鼠体重。

2.2HGAG对四氧嘧啶致实验性高血糖小鼠糖耐量的影响小鼠高血糖模型的建立、动物分组及给药方法均同2.1项下所述。各组小鼠于给药第28天以德国罗氏优越Ⅳ型血糖仪测定空腹5h的血糖值（FBG）后，经腹腔注射给予葡萄糖2g/kg，测定葡萄糖负荷后30min、60min、120min和240min血糖值，并按梯形面积法如下式计算糖耐量曲线下面积（AUC）［6］。

AUC（mmol·h/L）=n-1i=1Ci+Ci+12·t

式中，C为血糖值（mmol/L），t为葡萄糖负荷后时间（h），i为血糖值序号；C0、C1、C2、C3、C4分别为葡萄糖负荷前（0min）及葡萄糖负荷后30min、60min、120min和240min的血糖值。

2.3HGAG对胰岛素抵抗HepG2细胞模型的作用

2.3.1分组、给药及指标测定将制备好的HepG2细胞悬液计数，调整细胞浓度至5×104mL-1，接种于96孔细胞培养板，每组设8个复孔，每孔总量200μL。实验分5组：正常对照组、IR-HepG2模型组、HGAG高、低剂量组和二甲双胍阳性对照组。除正常对照组外，其余各组按文献方法复制IR-HepG2细胞模型［7-8］。造模后细胞换不含胰岛素的培养液孵育，各给药组分别以终浓度为HGAG250mg·L-1、HGAG500mg·L-1、二甲双胍30mg·L-1的培养液孵育。给药24h后，用葡萄糖氧化酶法检测培养液中葡萄糖，以未接种细胞空白复孔的糖含量均值相减，计算各孔细胞的葡萄糖消耗量。用GPO-POD酶法测定培养液中甘油的含量，以未接种细胞空白复孔的甘油含量均值相减，计算各孔细胞的甘油消耗量。

2.3.2MTT法测定药物对细胞增殖的影响将5g·L-1的MTT原液与无血清DMEM培养液按体积1：9配成MTT培养液，待移出用于测定葡萄糖和甘油消耗的细胞培养液后，每孔加入MTT培养液，37℃继续培养，4h后终止培养，并小心吸弃孔内的培养上清液，每孔加200μL二甲基亚砜，震荡10min，使结晶物充分溶解，于波长570nm下，在酶标仪中测定各孔吸光度值，计算细胞的存活%以评价药物对细胞增殖的影响。

2.4统计方法实验结果均以（χ±s）表示，数据处理使用SPSS12.0统计软件进行单因素的方差分析，p

3结果

3.1HGAG对四氧嘧啶致实验性糖尿病小鼠空腹血糖的影响由表1可知，与模型组相比，给药3W后，HGAG可呈剂量依赖性降低实验性高血糖小鼠空腹血糖。

3.2HGAG对四氧嘧啶致实验性糖尿病小鼠糖耐量的影响由表2可知，与模型组相比，50mg/kg刺海参糖胺聚糖可使糖耐量曲线下面积降低12%（p

3.3HGAG对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量及甘油消耗量的影响由表3和表4可知，HGAG在浓度为250mg/L和500mg/L时可使IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗量分别增加96.6%和114.2%（p

4讨论

本研究表明，给予HGAG3周可剂量依赖性地降低四氧嘧啶致高血糖小鼠的空腹血糖，改善小鼠体重进行性下降的症状，在实验中还可观察到给药组小鼠“多食多饮多尿”症状随剂量增加而有所改善；给予较大剂量HGAG4周时可降低四氧嘧啶致高血糖小鼠糖耐量曲线下面积。说明长期应用HGAG可改善糖尿病症状，降低血糖，增强糖耐受能力，有利于治疗糖尿病。

糖尿病是一种严重危害人类健康的内分泌代谢疾病，胰岛素抵抗是其发病的一个主要环节［1-3］。胰岛素抵抗主要发生于外周组织和肝脏，HepG2细胞源于肝细胞，具有肝细胞的许多生物学特性。本研究以体外胰岛素抵抗的HepG2细胞为研究对象，初步探讨了HGAG对体外IR-HepG2细胞葡萄糖和甘油消耗的影响。结果表明在不明显影响细胞增殖的情况下，HGAG可增加体外IR-HepG2细胞葡萄糖和甘油的消耗量，说明其可促进胰岛素抵抗的HepG2细胞对葡萄糖和甘油的利用，这可能与其降血糖作用有关。

参考文献

［1］贾伟平.胰岛素抵抗在2型糖尿病发病机制中的作用.诊断学理论与实践，2009，8（3）：233-236.

［2］LiCg，NingG，ChenJL.Establishmentandidentificationofinsulin-resistantHepG2cellline.ChinJDiabetes，1999，7（4）：198-2000.

［3］郭洁文，潘静锵，邱光清，李爱华，肖柳英，韩超.荔枝核增强2型糖尿病-胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性作用.中国新药杂志，2003，12（7）：526-529.

［4］陈世伟，张杰，刘翠娥，王海玉，李立，张炎，张桂霞.消渴胶囊对高血糖小鼠模型小鼠的降糖作用.现代预防医学，2006，33（2）：143-144.

［5］周小玲，孙平南，曹君君.绿茶阿拉伯半乳糖蛋白对四氧嘧啶致小鼠高血糖的预防作用.汕头大学医学院学报，2010，23（1）：16-18.

［6］Xin-boYang，Zheng-mingHuang，Wen-binCao，etal.Effectsofrhizomealismatisextractonbloodbiochemicalindicedandinsulininhyperglycemicmice.中国临床康复，2001，8（6）：1196-1197.

［7］PodskalnyJM，TakedaS，SilvermanRE，TRAnD，CarpentierJL，OrciL，GordenP.Insulinreceptorsandbioresponsesinahumanlivercellline（HepG2）.EurJBiochem，1985：150，401，407.

［8］邹玲莉，韩国柱，肇小茗，李秋莎，周琴，姜丽平，吕莉*.茶多酚对胰岛素抵抗及非胰岛素抵抗HepG2细胞体外糖脂代谢的影响.中成药，2010，32（8）：1411-1414.