秃疮花水溶性制剂的筛选试验

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摘 要：为了确定秃疮花水溶性制剂的检测标准，试验用秃疮花制剂生物学功能和凯氏定氮法对制剂进行筛选。试验结果表明秃疮花水溶性外用制剂平均含氮量2.29 %；秃疮花水溶性内用制剂平均含氮量1.67 %；制备的秃疮花水溶性制剂具有良好的抗菌和免疫调节功能。这说明试验建立的秃疮花水溶性制剂检测标准是合理的。

关键词：秃疮花；水溶性外用制剂；检测标准

中图分类号：R979.5 文献标识码：A 文章编号：1003-6997（2012）21-0027-03

秃疮花（Dicranostigma leptopodum（Maxim）Fedde），为罂粟科秃疮花属二年生或多年生草本植物，主要分布在甘肃、陕西等省。近年来我国许多研究者对秃疮花的成分和秃疮花制剂的药理作用进行了研究，畅行若[1]等和党岩[2，3]等从秃疮花中提取出秃疮花碱、异紫堇碱、紫堇碱、原阿片碱、别隐品碱、青风藤碱等多种化合物。卢贤昭等[4]研究表明，秃疮花对结核病有良好的治愈作用，治愈疗效79.5 %以上。陈正山、龚艳妮等[5-13]等的研究证明秃疮花对动物免疫系统、细菌、病毒真菌、外科疮伤和肿瘤均有作用。

为了将药用植物秃疮药应用于临床实践中，在分析秃疮花全草生物碱成分的同时[2，3]，以秃疮花制剂生物学功能为指标，用凯氏定氮法对制剂进行筛选，为制剂的制备建立检测标准，为外用制剂的应用奠定了试验基础。

1 材料

1.1 试验仪器

沙埚和沙布购自于甘肃省医药公司。天平、电炉、消煮炉、滴定管、凯氏烧瓶、凯氏蒸馏装置、锥形瓶、容量瓶、100 mL小缸、漏斗等来自甘肃省畜牧兽医研究所生物技术实验室。酶标仪（型号Model 680）、CO2培养箱（Asheville公司）、离心机等为西北农林科技大学动物医学学院预防兽医学试验平台仪器；96孔细胞培养板、细胞计数板、（0.1μL-1μL、1μL-10μL、10μL-100μL、100μL-1000μL、1 mL-10 mL）加样枪及EP管等购于欣博盛生物科技有限公司。

1.2 药物及试剂

秃疮花干粉末，将采集于平凉地区的秃疮花洗净，自然风干，粉碎。牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、SS琼脂粉、磷酸氢二钾、琼脂、酚红、NaOH、NaCl、HCl、乙醇、PH试纸等购自于上海生公；小鼠IFN-γELISA试剂盒、PBMI-1 640培养液、HEPES、L-谷氨酰胺、ConA、犊牛血清、NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaHCO3、葡萄糖、台盼蓝、青链霉素、两性霉素等购自于欣博盛生物科技有限公司；其余试剂均为国产或进口分析纯。

1.3 试验动物与试验用菌株

菌株：大肠杆菌为甘肃省畜牧兽医研究所实验室保存的标准菌株；试验动物Balb/c小鼠购于第四军医大学实验动物中心。

2 方法

2.1 秃疮花水溶性外用制剂的提取

准确秤取秃疮花干粉末，装入多层沙布袋内，扎紧袋口置于熬沙埚中，加入沸蒸溜水煮1 h后，将水煮液过滤并进行浓缩，药袋继续加入蒸溜水浸泡24 h后煮沸1 h，同样将煮液过滤浓缩。如此重复6次，将过滤物风干后置4 ℃保存备用。将所有煮液混合过滤，浓缩风干后置4 ℃保存备用。

2.2 秃疮花水溶性外用制剂的药用部分的筛选

合并同级过滤物，并将过滤物在药用乳钵中研成粉状备用。准确称取不同级别过滤物和红茂草提取液干物质，按干物质250 mg/mL分别用营养肉汤配制药液，加入106个大肠杆菌4 ℃作用72 h后，进行细菌计数。对秃疮花水溶性外用制剂的药用部分进行筛选。分别抽取3批不同时间制备的三级秃疮花水溶性外用制剂提取液干物质，进行含含氮量的测定。

2.3 秃疮花水溶性针剂的提取

准确秤取秃疮花干粉末三份，分别装入三个不同的锥形瓶中内，加入适量无水乙醇，用双蒸水将其乙醇浓度分别调至95 %、75 %、50 %，密封摇匀数次浸泡24 h后将上清液过滤备用，滤渣分别加入同浓度乙醇用同样的方法再处理三次。滤液合并蒸馏至无醇味为至，加入五蒸水定容，过滤后高压30 min置室温48 h，过滤浓缩至膏状，风干后置4 ℃保存备用，各级过滤物风干后置4 ℃保存备用。

2.4 秃疮花水溶性针剂的药用部分的筛选

准确称取用95 %、75 %、50 %乙醇提取的秃疮花液干物质，按干物质250 mg/mL分别用生理盐水配制药液备用。

选20只1月龄Balb/c小鼠，分成4组，每组5只，每组分别腹腔注射上面配制的药液和生理盐水（对照组），0.2 mL/只，连续注射7 d后，断颈处死小鼠，75 %乙醇消毒，无菌条件下取小鼠脾脏，分离淋巴细胞，用500 μL完全PBMI-1 640营养液重悬后，各分置96孔细胞培养板的4个培养孔中，每孔100 μL。各孔分别加入10 μg/mL的ConA100 μL，5 % CO2、37 ℃培养48 h。培养物分别离心取上清，测定IFN-γ浓度，对秃疮花水溶性针剂的药用部分进行筛选。分别抽取3批不同时间制备的75 %乙醇提取的秃疮花液制剂干物质，进行含氮量的测定。

2.5 秃疮花水溶性制剂含氮量的测定（半微量凯氏定氮法）

2.5.1 试样消煮 准确称取各样品1 g加入凯氏烧瓶中。在所有样品中分别加入3 g混合催化剂（0.4 gCuSO4与6 gK2SO4）与12 mL的98 % H2SO4摇匀置于电炉上先进行小火加热，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力直至透明的蓝绿色，继续加热1 h。

2.5.2 氨的蒸馏（半微量蒸馏） 取试样消煮液，冷却，定溶至100 mL进行蒸馏。将蒸馏装置的冷凝管末端浸入盛有20 mL硼酸吸收液和加了2滴混合指示剂的锥形瓶中。准确吸取消化液10 mL于反应管内随即加入2滴甲基红指示剂，经漏斗加入10 mL40 % NaOH溶液，用少量蒸馏水密封漏斗，夹好漏斗夹，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏。指示剂变为蓝绿色后继续加热5 min，降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏1～2 min，并用水冲洗冷凝管末端，洗液需流入锥形瓶中，然后停止蒸馏。每个样品重复2～3次。

2.5.3 滴定 将蒸馏后接收瓶内的吸收液立即用0.01 mol/L的盐酸标准溶液滴定至终点，即溶液由蓝绿色变成灰红色。

2.5.4 计算 总氮含量（%）=（N（V2-V1）×0.014）/W×1 000

0.014为氮的毫克当量数，N为盐酸标准液的当量浓度，V1为试剂空白消耗盐酸标准液的体积，V2为样品消耗盐酸标准液的体积，W为所测样品质量。

允许差：两个平行试样测定结果之差不大于0.2 %，以其算术平均值报告结果。

3 结果

3.1 秃疮花水溶性外用制剂的药用部分的筛选结果

秃疮花水溶性外用制剂的药用部分的筛选结果见表1。

3.2 秃疮花水溶性针剂的药用部分的筛选结果

秃疮花水溶性针剂的药用部分的筛选结果见表2。

3.3 秃疮花水溶性制剂含氮量的测定结果

秃疮花水溶性制剂含氮量的测定结果见表3。

从表3可以看出，三级秃疮花水溶性外用制剂提取液制剂平均含氮量2.29 %；75 %乙醇提取的秃疮花液针剂平均含氮量1.67 %。

4 讨论

从秃疮花水溶性外用制剂的药用部分的筛选结果可以看出，水提取液的杀菌效果明显高于水提取液的沉淀物，两者之间差异极显著（P

根据实验结果，确定了制备秃疮花水溶性制剂的检测标准：秃疮花水溶性外用制剂一个标准单位含干物质250 mg/mL，4 ℃72 h对106个大肠杆菌杀死率大于95 %，平均含氮量2.29 %；秃疮花水溶性针剂一个标准单位含干物质25mg/mL，连续注射7 d使1月龄Balb/c小鼠的5×105个淋巴细胞体外培养（加入10μg/mL的ConA 100μL，5 %CO2、37 ℃培养48 h）液中IFN-γ平均含量大于450 pg/mL，平均含氮量1.67 %。

参考文献：

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