运用血清蛋白质组分析方法筛选乳腺浸润性导管癌相关抗原

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【摘要】目的：筛选乳腺浸润性导管癌相关抗原（TAA），为研究乳腺癌的发生、发展机制及防治方案提供依据。方法：体外培养人乳腺浸润性导管癌细胞株T-47D并提取总蛋白，取T-47D细胞总蛋白经双向电泳技术（2-DE）分离后转膜，分别用20例健康人（N组）血清和20例乳腺浸润性导管癌患者（乳腺癌组）血清作为一抗进行Western blot分析，找出差异蛋白、经胰酶酶解后进行液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）鉴定。结果：筛选出10个差异蛋白，经LC-MS/MS鉴定为热休克蛋白90、脯氨酰-4-羟化酶β亚基、内质网-60蛋白酶、热休克蛋白60、未命名蛋白、人类真核翻译延伸因子1γ、假想蛋白、热休克蛋白27、磷酸甘油酸变位酶1和核糖体蛋白P0。结论：本研究发现了10个可能的乳腺浸润性导管癌TAA，此为进一步研究乳腺癌的发生、发展机制及防治方案提供了一定的实验基础。

【关键词】乳腺浸润性导管癌；双向电泳；血清蛋白质组分析；相关抗原

【中图分类号】R722.12 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）04-0144-02

贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目（2005-298）；贵州省科学技术基金项目（黔科合J字2007-2086）

乳腺浸润性导管癌是乳腺癌中最常见的一种类型，预后较差[1]。肿瘤相关抗原（TAA）是在肿瘤发生、发展过程中高表达的，能够诱发机体发生免疫应答的抗原。血清学蛋白质组分析（SERPA）是一种基于蛋白质组学和免疫学原理，利用二维电泳和质谱分析方法筛选和鉴定TAA的新技术[2]，目前已被广泛应用于肿瘤、自身免疫性疾病及感染性疾病的研究中[3]，但其在乳腺浸润性导管癌研究中应用的报道尚少。我们采用SERPA方法对乳腺浸润性导管癌TAA进行了筛选，以期为该病的发生、发展机制研究及辅助诊断提供基础。

1材料

1.1标本来源

收集贵阳医学院附属医院2010年12月至2011年3月期间收治的20例女性乳腺浸润性导管癌患者（无其它自身免疫性疾病）的静脉血清作为实验组，所有病例取材得知情同意，采血和手术前未进行放疗、化疗和内分泌治疗，年龄范围34-78岁，平均年龄49.5岁；所有患者组织标本均经病理结果证实，按国际抗癌协会（UICC）制定的乳腺癌分期标准（TNM分期法）分为Ⅰ期6例，Ⅱ期7例，Ⅲ期7例。另外同期采集20例健康女性志愿者静脉血清作为对照组，年龄范围36-75岁，平均年龄52.8岁。健康志愿者均经系统健康体检，无乳腺相关疾病史、其它自身免疫性疾病和恶性肿瘤家族史。人乳腺浸润性导管癌细胞株T-47D细胞购自中国科学院细胞库。纳入本研究者采其空腹静脉血5ml，尽快分离血清并置-80℃冰箱保存。

1.2主要试剂

高糖DMEM培养基购于美国Gibco公司；IPG胶条（13cm，pH3-10）、裂解液购自Amershan biosciences公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG（HRP-兔抗人IgG）购自武汉博士德公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜购自美国Millpore公司；ECL化学发光试剂盒购自美国Pierce公司。

2 方法

2.1 细胞培养及总蛋白的制备

用含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于5%CO2细胞培养箱中培养。收集对数生长期的细胞，加入5倍体积裂解液（7M尿素，2M硫尿，4%CHAPS，65mM DTT，0.2%Bio-Lyte）混匀，液氮中反复冻融3-4次（每次置液氮中3秒，室温融化），加入20ug/ml脱氧核糖核酸酶，离心1小时（4℃，20000×g），取上清即为细胞总蛋白。用Bradford法检测浓度，将样品分装并且置-80℃保存。

2.2 双向电泳和Western blot分析

取700μg T-47D全细胞蛋白进行2-DE，2-DE操作按照说明书进行。2-DE所得凝胶经考马斯亮蓝R-250染色液染色2h；并脱色至蛋白点清晰可见为止。

T-47D细胞总蛋白经双向电泳分离后，半干转印法转印至PVDF膜并封闭2h，分别与1：100稀释的乳腺浸润性导管癌或对照血清（一抗）于室温孵育2h，用TBST洗膜液洗膜（10min×3次）；其次与辣根过氧化物酶标记的兔抗人（1：3000）二抗室温孵育2h；再经TBST溶液洗膜（10min×3次）；最后经ECL化学发光检测得到胶片；观察杂交信号点，并确定发生免疫反应的蛋白在双向电泳凝胶上的位置。

2.3 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件，用X2检验对与患者血清和对照血清发生免疫反应的蛋白进行分析，p

2.4候选蛋白酶解和质谱鉴定

选取2-DE凝胶上候选蛋白质斑点经胰酶酶解，肽段经液相色谱串联质谱（Liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析，用Mascot搜索引擎搜索NCBInr数据库，获知氨基酸序列。

3 结果

3.1 T-47D细胞总蛋白2-DE分析

使用图像分析软件对T-47D细胞总蛋白双向电泳图谱进行分析，在分子量为14.4.0kDa-94kDa和等电点pI3.0-10.0的范围内，发现约630个蛋白质点（图1）。

3.2 T-47D细胞总蛋白与血清的Western blot分析和统计学分析

T-47D细胞总蛋白和对照血清发生免疫反应的蛋白较少，大约为4个蛋白点（图2）；而其与患者血清发生免疫反应的蛋白较多，大约14个蛋白点（图3）。采用SPSS17.0软件对与患者血清和对照血清发生免疫反应的蛋白进行统计学分析，筛选出10个差异蛋白（表1）。这10个差异蛋白分别与对照组（N）和实验组（BC）血清发生免疫反应印迹图（图4）；确定这10个差异蛋白在2-DE凝胶上的位置，其主要分布在分子量为22.0kDa-94kDa和等电点pI4.7-6.7的范围内（图5）。

4 讨论

分离鉴定TAA有可能发现新的辅助早期诊断、预后判断和疗效监测的候选肿瘤标志物。本研究运用SERPA方法对引起乳腺浸润性导管癌患者发生体液免疫反应的抗原进行检测并筛选出10个抗原，经质谱鉴定及数据搜索，鉴定出其中8个抗原的功能，主要涉及到分子伴侣、能量代谢、细胞信号；有两个抗原未鉴定出功能。HSP90、P4HB、ER-60、HSP60、HSP27属于分子伴侣蛋白，是原核和真核生物细胞在应激状态下可被诱导表达的一类具有重要生理功能和高度保守的多肽类蛋白质分子家族。多项国内外研究[4]显示，上述五种蛋白在乳腺癌患者体内表达升高，本研究结果与之一致。PGAM1是一种糖分解酶，主要在糖酵解过程中起作用，因而能促进癌细胞等糖酵解旺盛的细胞生存。研究发现，PGAM1在肺癌、肝癌和食管癌中表达明显升高，但在乳腺癌肿瘤抗原方面的研究罕见报道。因此，PGAM1在乳腺浸润性导管癌中的作用值得进一步探讨。EEF1G和P0属于信号类蛋白，其中EEF1G含有N-末端谷胱甘肽S转移酶域，可与氨基酰-tRNA结合，将其运至核糖体，使肽链延长；P0是一种多功能蛋白，参与翻译过程中的调节机制。有研究[5]发现，EEF1G和P0在乳腺癌组织中的表达明显升高，但P0表达升高或降低在病理、生理代谢中的具体作用目前尚未清楚，其在乳腺浸润性导管癌中的作用待于进一步研究。本研究中两个未鉴定出功能的蛋白是未命名蛋白和假想蛋白，其结构和功能还不清楚。

参考文献

[1]吴骥，管小青，顾书成等.COX一2及Ki67在乳腺浸润性导管癌组织中的表达及临床意义[J].中国肿瘤外科杂志，2013，5（5）：296-299.

[2]Oaks M， Taylor S， Shaffer J. Autoantibodies targeting tumor-associated antigens in metastatic cancer[J].OncoImmunology， 2013， 2（6）， e24841.

[3] 李良宏.乳腺癌中HSP90和Caspase-3的表达及其与临床病理、预后的关系[J].疑难病杂志，2012，11（4）：271-273.

[4] Aka JA， Lin SX. Comparison of functional proteomic analyses of human breast cancer cell lines T47D and MCF7[J]. PLoS One， 2012， 7（2）：e31532.

[5] 高红军，岳志冈，郑 敏等.一种肿瘤相关抗原在食管鳞状细胞癌中的鉴定与表达[J].中国医学科学院学报，2012，34（3）：244-248.