烟草土壤微生物与土壤酶活性分析

摘要：从湖北省恩施咸丰县烟田采集烟草（Nicotiana tabacum L.）不同生长时期的土壤样品，采用稀释平板涂布法进行细菌、放线菌、氨化细菌、硝化细菌、真菌的分离并对土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶、过氧化氢酶进行酶活性的测定。试验结果表明，①土壤中氨化细菌数量最多，真菌数量最少。各种类群微生物在烟草整个生育期间变化波动较大，不同类群微生物消长趋势不同，整体呈上升趋势；其中，烟草生长旺盛期微生物数量最多。②在烟草生长前期，土壤脲酶活性较高；磷酸酶活性在前、中期均处于比较高的水平；在后期，随着土壤熟化程度的提高，蔗糖酶活性增强较明显；过氧化氢酶活性在各个时期的变化较平稳。

关键词：烟草（Nicotiana tabacum L.）；土壤微生物；土壤酶活性

中图分类号：S572 文献标识码：A 文章编号：0439—8114（2012）19—4229—04

烟草（Nicotiana tabacum L.）是一种特殊的叶用经济作物，其生长发育和质量形成与土壤生物学特性和生态环境有着密切的关系。土壤微生物是土壤的重要组成部分，它对土壤肥力的形成和植物营养的转化起着积极的作用[1]。土壤微生物种类、数量可以作为评价土壤肥力的指标[2]。土壤酶活性与土壤微生物类群密切相关，土壤酶活性反映了土壤微生物群落的代谢状况。土壤微生物和土壤酶既是土壤有机物转化的执行者，又是植物营养元素的活性库[3]。此外，酶是土壤组分中最活跃的有机成分之一，土壤酶活性反应了土壤的生物学活性。研究烟草土壤中微生物类群和数量以及土壤酶活性随着烟草不同生长时期的变化动态有助于分析影响烟草生长发育的土壤生态因子。本试验对湖北省恩施咸丰县烟田不同生长时期的土壤微生物进行分离，并对土壤酶活性进行测定，分析了土壤微生物数量和土壤酶活性在烟草不同时期的差异和变化动态，探索土壤微生物、酶活与烟草生长的关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试样品采自湖北省恩施咸丰县高乐山镇小模村烟田。土壤类型为黄棕壤，质地疏松，通透性好。年平均气温15～17 ℃，年降水量为1 300～1 500 mm，相对湿度80%。栽培烟草品种为云烟87，使用肥料为烤烟专用复合肥。供试细菌、放线菌、真菌、氨化细菌、硝化细菌所用培养基分别为LB培养基、高氏一号培养基、PDA培养基、蛋白胨氨化培养基、硝化细菌培养基。供试仪器为720型分光光度计、恒温培养摇床、恒温培养箱。供试试剂为0.3%过氧化氢、3，5—二硝基水杨酸、蔗糖、磷酸苯二钠、4—氨基安替吡啉、钾铝矾等。

1.2 试验方法

1.2.1 采样方法 分别在烟草施用基肥前1 d（移栽前）、移栽当天，移栽后15、30、45、60、75、90 d和采收完毕后采集土样，共9次。挖取烟株之间垄上土壤耕层0～20 cm表层、中层和底层的土壤，混匀，用保鲜袋装好，贴好标签。

1.2.2 样品处理 土样采回后立即对土壤微生物进行分离。用于土壤酶活性测定的土样及时风干、过筛，放置于室温保存。

1.2.3 测定方法

1）土壤微生物的分离及数量测定。采用稀释涂布平板法进行土壤微生物的分离[4，5]。称取10 g土壤样品，放入90 mL无菌水中，搅拌均匀。将土壤悬液进行10倍系列梯度（10—3、10—4、10—5、10—6、10—7）稀释，吸取不同稀释浓度的土壤悬液进行各种微生物的分离。将分离培养的细菌放入37 ℃培养箱中培养2 d；放线菌放入28 ℃培养箱中培养7 d；氨化细菌放入28 ℃培养箱中培养5 d；硝化细菌放入28 ℃培养箱中培养7 d；真菌放入28 ℃ 培养箱培养7 d。菌落数量采用平板菌落计数法，每个稀释度做3次重复。计算公式：微生物数量（CFU/g）=同一稀释度3次重复平均菌落数×稀释倍数×100。

2）蔗糖酶活性的测定。采用3，5—二硝基水杨酸比色法[6，7]。以蔗糖为基质，根据酶促产物葡萄糖与3，5—二硝基水杨酸生成有色化合物3—氨基—5—硝基水杨酸的量进行比色测定。同时做标准曲线、无基质对照和无土壤对照试验。蔗糖酶活性（mg/g）以24 h后每克土样所产生葡萄糖的质量来表示。

3）脲酶活性的测定。采用比色法[6，7]。以尿素为基质，酶促水解后生成的氨在强碱性溶液中与苯酚钠及次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，以其生成数量与氨浓度成正比来进行定量分析。同时做标准曲线、无基质对照和无土壤对照试验。土壤脲酶活性（mg/100 g）以100 g土中NH3—N的含量表示。

4）磷酸酶活性的测定。采用磷酸苯二钠比色法。其原理是磷酸苯二钠作为基质被土壤磷酸酶水解后生成酚，测定酚的质量即可确定磷酸酶的活性[6，7]。磷酸酶活性（mg/g）以每克风干土壤中的酚含量来表示。

5）过氧化氢酶活性的测定。采用紫外分光光度计法[8]。基于过氧化氢酶能酶促过氧化氢分解生成水和氧气，通过加入等量过量的过氧化氢与土壤作用一段时间，加入量与剩余量之差即为被酶催化反应消耗的过氧化氢，以此表示酶活性。过氧化氢在240 nm处有强烈吸收，通过测定与土壤反应后溶液在此波长下的吸光度，即可得到溶液中过氧化氢的浓度，计算酶的活性。过氧化氢酶的活性（mg/g）用每20 min内每克土壤分解的过氧化氢的量表示。

2 结果与分析

2.1 土壤微生物数量的变化

从试验结果（表1）可见，土壤中氨化细菌数量最多，真菌数量最少。烟草生长中期（移栽后45 d）土壤微生物数量最多，达到了4.7×107 CFU/g，早期（移栽当天）和末期（采收后）土壤微生物数量较少，说明烟草生长旺盛期土壤具有丰富的微生物。移栽前微生物数量较多，而移栽时数量减少，这可能是由于施肥、翻土等农事操作对土壤中微生物的生长环境影响较大。

不同种类的微生物数量在烟草不同生育期的变化趋势不同。其中，土壤中细菌数量移栽前最多，达4.2×106 CFU/g土，移栽当天数量急剧下降。在烟草生长前期土壤中细菌数量（移栽当天至移栽后30 d）变化较小、中期（移栽后45 d）明显上升，移栽后60 d又明显下降，之后一直呈上升趋势。土壤中真菌数量除早期（移栽时）较少外，其余时期均较多，尤其是中、后期真菌数量最多。土壤中放线菌数量在生长前、中期数量较多，后期数量明显上升，移栽后90 d达到最高值，为2.2×106 CFU/g 土。土壤中硝化细菌数量变化不明显，在生长中、后期有缓慢增加的趋势。土壤中氨化细菌数量随着时间的推移变化幅度比较大，在烟草不同生长时期出现两次高峰，分别是移栽后15 d和45 d，在烟草生长后期氨化细菌数量也较多。

2.2 土壤酶活性的变化

2.2.1 蔗糖酶活性 蔗糖酶能酶促蔗糖水解成葡萄糖和果糖。随着土壤熟化程度的提高，蔗糖酶的活性亦增强。常用土壤蔗糖酶活性表征土壤的熟化程度和肥力水平。土壤中蔗糖酶活性在前期（移栽前至移栽后15 d）缓慢下降；移栽后30～60 d蔗糖酶活性较低，移栽后75 d蔗糖酶活性显著上升，移栽后90 d蔗糖酶活性最高，为11.49 mg/g（图1）。表明在后期，随着土壤熟化程度的提高，蔗糖酶活性增强较明显。

2.2.2 脲酶活性 脲酶是一种酰胺酶，能酶促有机质分子中肽键的水解。土壤中脲酶活性在前期变化较大，在移栽后15 d上升至最高值，为538.89 mg/100 g土，此后脲酶活性下降至较低水平，后期脲酶活性又缓慢上升（图2）。

2.2.3 磷酸酶活性 土壤中磷酸酶活性在前、中期（移栽前至移栽后60 d）均处于比较高的水平；移栽后60 d磷酸酶活性最高，为26.34 mg/g ；移栽后75 d磷酸酶活性急剧下降；此后，磷酸酶活性上升至之前水平（图3）。总体来说，土壤磷酸酶活性较高。

2.2.4 过氧化氢酶活性 土壤中过氧化氢酶活性在各个时期变化较平稳，移栽前酶活最高，为0.99 mg/g；此后过氧化氢酶活性缓慢下降，在中、后期（移栽后45 d至采收完毕）酶活变化不明显（图4）。土壤过氧化氢酶的活性代表了土壤的呼吸强度，表明土壤呼吸强度较稳定，在烟草的整个生育期变化不明显。

3 小结与讨论

3.1 土壤微生物在烟草不同生长时期的变化

烟草根际土壤中氨化细菌数量最多，真菌数量最少。烟草生长中期（移栽后45 d）土壤微生物数量最多，早期（移栽当天）和末期（采收后）土壤微生物数量最少，说明烟草生长旺盛期土壤微生物类群丰富，种群数量大。

土壤中各种类群微生物在整个生育期间变化波动较大，不同类群微生物消长趋势不同，整体呈上升趋势。放线菌数量在生长前、中期数量较多，后期数量明显上升。土壤中的放线菌多数可产生抗生素，拮抗土壤中的病原菌，烟草根际土壤中放线菌数量在烟草生长后期增加将有益于防治烟草病害。土壤中的氨或铵盐在硝化细菌（亚硝酸细菌、硝酸细菌）的作用下转变为硝酸盐，NO3—N是作物良好的有效态养分，增加了植物可利用的氮素营养，土壤中硝化细菌的活动可提高土壤肥力[6]。土壤中硝化细菌数量在烟草生长中、后期增加，可促进烟草对氮肥的吸收利用。土壤中含氮的有机物在氨化细菌作用下分解释放出氨，氨与土壤中的酸根结合成铵盐，再经硝化细菌的作用转化成硝酸盐，增强土壤肥力。氨化细菌数量与土壤肥力成正相关，土壤中氨化细菌数量在烟草生长中、后期较多，可促进土壤肥力及烟草的生长。

3.2 土壤酶活性在烟草不同生长时期的变化

土壤中不同种类酶活在烟草不同生长时期变化趋势不同，烟草生长前期的脲酶、过氧化氢酶、磷酸酶活性较高。土壤中脲酶活性可用于表征土壤中的氮素状况，土壤中脲酶活性在烟草生长早期较高将有利于氮元素的吸收和利用。磷酸酶能促进有机磷化合物的水解，表征土壤磷的肥力状况。磷酸酶活性在前、中期均处于比较高的水平，表明土壤磷的肥力良好。随着土壤熟化程度的提高，后期蔗糖酶活性增强较明显。

参考文献：

[1] 杜秉海，李贻学，宋国菡，等.烟田土壤微生物区系分析[J].中国烟草科学，1996（2）：30—32.

[2] 许景伟，王卫东，李 成.不同类型黑松混交林土壤微生物、酶及其与土壤养分关系的研究[J].北京林业大学学报，2000，22（1）：51—55.

[3] 李倩茹，符夏梨.红树林土壤微生物与土壤酶活性分析[J].广东农业科学，2009（7）：93—96.

[4] 李振高，骆永明，滕 应.土壤与环境微生物研究法[M].北京：科学出版社，2008.

[5] 黄 珏.硝化细菌的分离鉴定[J].水产科技情报，2004，31（3）：130—134.

[6] 关松萌.土壤酶及其研究法[M].北京：农业出版社，1986.

[7] 周礼恺.土壤酶学[M].北京：科学出版社， 1987.254—260.

[8] 杨兰芳，曾 巧，李海波，等.紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性[J].土壤通报，2011，42（1）：207—210.

[9] 陈红军，孟 虎，陈钧鸿.两种生物农药对土壤蔗糖酶活性的影响[J].生态环境，2008，17（2）：584—588.