芹菜素对雄性小鼠肝脏组织总抗氧化能力、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽值、丙二醛含量影响研究

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[摘要] 目的 观察不同剂量、不同作用时间芹菜素对雄性小鼠肝脏总抗氧化能力（T-AOC）、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）、丙二醛（MDA）含量的影响。 方法 200只成年SPF级昆明种雄性小鼠随机分为对照组（生理盐水10 mL/kg）、低剂量组（芹菜素 252 mg/kg）、中剂量组（芹菜素 504 mg/kg）和高剂量组（芹菜素1008 mg/kg）。连续灌胃7、14、21、28、35 d，分批处死，称取肝脏制备匀浆，测定T-AOC、GSH、GSSG及MDA含量。 结果 高剂量组T-AOC含量[（1.397±0.641）U/mg]显著低于对照组[（1.573±0.781）U/mg]（P = 0.000）；芹菜素灌胃28 d GSH/GSSG值相对对照组升高幅度最大（140.556%）；高剂量组灌胃21 d MDA含量[（1.068±0.729）nmol/mg]显著高于对照组[（0.354±0.212） nmol/mg]（P = 0.000）。 结论 1008 mg/kg芹菜素对小鼠肝脏组织T-AOC具有一定的抑制作用，并可增加肝脏脂质过氧化程度。T-AOC可以比较早地反映出机体抗氧化能力的变化。

[关键词] 芹菜素；总抗氧化能力；还原型谷胱甘肽；氧化型谷胱甘肽；丙二醛

[中图分类号] R992 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（c）-0007-03

芹菜素是天然存在的一种黄酮类化合物，广泛存在于多种水果、蔬菜、豆类和茶叶中[1]，具有抗氧化作用等多方面的生物学活性[2]。据报道芹菜素具有广泛的抗氧化作用。但隋海霞等[3]、Skibola等[4]体外研究结果显示，大剂量摄入黄酮类化合物，反而会使其成为致突变剂、促氧化剂，产生氧自由基而产生毒副作用。因此，对于芹菜素的抗氧化作用机制及有效剂量范围有必要进一步研究。本研究采用不同剂量芹菜素对成年雄性小鼠灌胃，在不同的观察时间点测定总抗氧化能力（T-AOC）、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）、丙二醛（MDA）含量，探讨芹菜素对肝脏抗氧化分子影响的剂量效应和时间效应，为芹菜素功效的深入研究及开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

成年健康SPF级昆明种雄性小鼠200只（动物合格证号编号为SCXK（甘） 2011-0001-0001067），饲养在甘肃中医学院中心实室的SPF级实验室内，按体重随机分为对照组（生理盐水10 mL/kg bw）、低剂量组（芹菜素252 mg/kg bw）、中剂量组（芹菜素504 mg/kg bw）和高剂量组（芹菜素1008 mg/kg bw），每组各50只。

1.2 试剂与仪器

芹菜素购于陕西惠科植物开发有限公司（生产批号：HK20110105），经HPLC检测，芹菜素纯度为98%，用蒸馏水配制成所需浓度。总抗氧化能力测定试剂盒（生产批号：20120328），总谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽测定试剂盒（生产批号：20120425）和丙二醛测定试剂盒（生产批号：20120221）均购自南京建成生物工程研究所。722型分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），JA3003N 电子秤（上海精密科学仪器有限公司），LD4-2 离心机（北京医用离心机厂），DK-600S 型三用恒温水浴箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.3 方法

各组每天给予生理盐水或不同浓度的芹菜素灌胃1次，连续7、14、21、28、35 d。根据时间点分批处死动物，每批各10只，取出肝脏，称取0.2～0.4 g肝脏加入9倍体积的匀浆介质，研磨成匀浆，置于离心机内3000 r/min离心10 min，取上清液测定。T-AOC、总谷胱甘肽、GSH、GSSG、MDA含量及组织蛋白的检测均按试剂盒说明书操作。

1.4 统计学方法

使用SAS 9.1.3完成析因分析和方差分析[5-7]。计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示。首先通过GLM过程初步分析时间和剂量因素间是否存在交互作用。若存在交互作用，则控制其中一个因素在某个水平上，比较另一个因素各水平间的差异[6]；如不存在交互作用而存在剂量效应，则忽略时间因素，将不同时间同一剂量组的数据合并到该剂量组下再比较各剂量组间的差异；若不存在交互作用而存在时间效应，则忽略剂量因素，将同一时间的高、中、低三组合并为处理组，按照“变化幅度=（处理组-对照组）/对照组×100%” 计算并绘制处理组变化幅度随时间变化的曲线。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芹菜素对肝脏组织总抗氧化能力、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽、丙二醛影响的析因分析

在不同时间观察点，小鼠T-AOC、GSH/GSSG、MDA测定结果，详见表1。经析因分析，T-AOC的时间因素和剂量因素间无交互效应，存在时间效应和剂量效应；GSH/GSSG无时间和剂量的交互效应及剂量效应，存在时间效应；MDA存在时间和剂量的交互效应和时间效应，无剂量效应。见表2。

2.2 芹菜素对肝脏组织总抗氧化能力的影响

剂量-效应分析：低、中、高剂量组T-AOC均低于对照组，高剂量组与对照组比较，差异有统计学意义（P = 0.000）；进一步对芹菜素剂量与T-AOC的关系进行Pearson相关性分析，得r = -0.194（P = 0.001），即随芹菜素剂量增加T-AOC下降，呈现一定的剂量-反应关系。见表3。

时间-效应分析：芹菜素处理组21 d T-AOC高于对照组，其他时间芹菜素处理组T-AOC均低于对照组，35 d处理组T-AOC与对照组相比降低幅度最大，为-23.696%。见图1。

2.3 芹菜素对肝脏组织还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽影响

时间-效应分析：芹菜素处理组28 d GSH/GSSG值相对于对照组变化幅度最大，为140.556%，其他时间芹菜素处理组GSH/GSSG均低于对照组。见图2。

2.4 芹菜素对肝脏组织丙二醛的影响

在同一时间点上观察剂量-效应：21 d时高剂量组MDA含量高于对照组（P = 0.000）。见表1。

在同一剂量水平上观察时间-效应：低剂量组MDA含量在14 d时增高，其后逐渐降低，到35 d时降低幅度最大；中剂量组MDA含量21 d时增高幅度相对较大；高剂量组MDA含量14 d时明显下降，21 d时显著升高，变化尤为突出。见图 3。

3 讨论

T-AOC涉及到非酶抗氧化防御体系，过多自由基的产生会降低T-AOC，衰老时在所有组织中T-AOC明显降低[8]。T-AOC可以用来评价生物活性物质作用于生物体后体内抗氧化防御系统的状况。本次实验结果显示，随芹菜素灌胃剂量增加，T-AOC含量表现为下降的趋势（r = -0.194，P = 0.001）；高剂量组T-AOC明显低于对照组；提示芹菜素1008 mg/kg bw灌胃对T-AOC具有一定的抑制作用。

总谷胱甘肽是重要的解毒剂和活性蛋白保护剂，可提高机体的抗氧化水平[9]。GSSG与GSH的转化是磷酸戊糖循环的重要组成部分，GSH/GSSG的比值越大，表明机体抗氧化能力越强。外源性补充的核糖在核糖激酶的作用下，磷酸化为5-磷酸核酮糖（R-5-P），进入磷酸戊糖途径。R-5-P作为磷酸戊糖途径的中间产物之一，其含量在体内增加加速磷酸戊糖的循环。磷酸戊糖循环的主要功能之一是产生还原当量，以NADPH的方式参与GSSG转化为GSH的反应[9]。因此，GSH/GSSG值比GSSG更有意义。本研究结果未显示出芹菜素对GSH/GSSG影响的时间与剂量的交互作用和剂量效应；28 d时芹菜素处理组GSH/GSSG值较对照大幅度增高，不除外芹菜素对肝脏组织抗氧化能力影响的亚急性作用，需进一步研究证实。

MDA是由于生物体内过量存在的超氧阴离子，使抗氧化防御系统失衡，生物体内发生自由基氧化过程而形成的产物，是反映机体脂质过氧化程度的指标[10]。MDA含量的变化可间接反映组织中自由基含量的变化。本研究中21 d时高剂量组MDA含量显著高于同期对照组，提示芹菜素1008 mg/kg bw灌胃可能会增强小鼠肝脏组织脂质过氧化程度。

本研究结果显示，与对照组比较，芹菜素处理组T-AOC，除21 d时有小幅升高外，7、14、28、35 d均处于较低水平；芹菜素处理组GSH/GSSG，除28 d时一过性升高外，7、14、21、35 d均处于较低水平；芹菜素处理组MDA，除21 d时一过性升高外，7、14、28、35 d呈现逐渐降低趋势。T-AOC及MDA的变化，21 d时达到高峰，提示21 d可能是芹菜素致肝脏T-AOC变化的敏感时期；GSH/GSSG的变化，28 d时达到高峰，提示在反映机体抗氧化能力变化敏感性上，GSH/GSSG比T-AOC和MDA滞后1周。本研究认为，测定T-AOC可以比较早地反映出机体抗氧化能力的变化。

[参考文献]

[1] 孙秀琴，李荣华，唐涛，等.芹菜素抗氧化作用研究进展[J].中国现代医生，2009，47（27）：103-107.

[2] 孙斌，瞿伟菁，张晓玲，等.芹菜素的药理学作用进展[J].中药材，2004，27（7）：531-535.

[3] 隋海霞，徐海滨，荫士安，等.大剂量芹菜素对大鼠抗氧化酶活性及DNA损伤影响的研究[J].国外医学：卫生学分册，2008，35（2）：103-107.

[4] Skibola CF，Smith MT. Potential health impacts of excessive flavonoid intake [J]. Free Radic Biol Med，2000，29（34）：375-383.

[5] 胡良平，郭辰仪.用SAS软件实现析因设计定量资料的统计分析[J].药学服务与研究，2012，12（4）：249-251.

[6] 万华，李晓松，苏茜，等.多元析因设计的方差分析及其SAS程序实现[J].现代预防医学，2010，37（5）：804-806.

[7] 郭晋，胡良平，高辉，等.用SAS软件实现析因设计定量资料的统计分析[J].中国医药生物技术，2010，5（1）：804-806.

[8] 王峰，王晓炜，陶明煊，等.大球盖菇多糖清除自由基活性和对D-半乳糖氧化损伤小鼠的抗氧化作用[J].食品科学，2009，30（5）：233-238.

[9] 刘丽萍，柴戟风，唐卫平，等.游泳训练对大鼠组织自由基代谢及肝脏超微结构的影响[J].中国运动医学杂志，1998，17（2）：121-123.

[10] 陈海刚，马胜伟，林钦，等.氯化三丁基锡对黑鲷鳃和肝组织SOD、MDA和GPx的影响[J].南方水产，2009，5（2）：23-27.

（收稿日期：2013-01-21 本文编辑：程 铭）