桂枝茯苓胶囊对体外人宫颈癌Hela细胞抑制作用及机理研究

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收稿日期:2009-11-06

基金项目:浙江省教育厅基金资助项目(20060721)

作者简介:黄燕芬(1974-),女,浙江金华人,副教授,主要从事中药成分的分离与中药药理研究。

摘 要:目的:研究桂枝茯苓胶囊对体外培养人宫颈癌hela细胞的增殖抑制作用和作用机理的初步研究。方法:MTT比色法观察桂枝茯苓胶囊对人宫颈癌Hela细胞增殖的抑制作用;免疫组化检测Fas、Fas L、Bcl-2基因的表达;western-blot和RT-PCR检测对人宫颈癌Hela细胞Caspase-3蛋白和Caspase-3 MRNA的表达影响;DNA-Ladder检测凋亡条带。结果:桂枝茯苓胶囊对人宫颈癌Hela细胞有明显的抑制作用(P

关键词:桂枝茯苓胶囊;宫颈癌Hela细胞;MTT;western-blot;免疫组化

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0774-04

Study of Inhibition and Mechanism on Hela of Guizhi Fuling Capsule in Vitro

HUANG Yanfen,DONG Gaixia,CHAI Hui, YUAN Xiaofeng

(Life Science Institute,Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, Zhejiang,China)

Abstract:Objective: To study the effects on anti-proliferation and its mechanism on the Hela of Guizhifuling Capsule. Methods: The inhibitory effect on Hela cell proliferation was assayed by MTT. Fas,FasL,Bcl-2 gene's expression was detected by Immunohistochemistry. caspase-3 MRNA and protein were detected by Western-blot and RT-PCR. Results: Guizhifuling Capsule have obvious effect on anti-proliferation of Hela cells (P

Key words:Guizhifuling capsule; Hela; western-blot; immunohistochemistry; RT-PCR

宫颈癌是发生在全球妇女中仅次于乳腺癌的第2个常见的恶性肿瘤[1]。临床上治疗常用化疗药物,化疗药物副作用大,容易产生耐药性。中药治疗肿瘤已经越来越受医务人员和患者青睐。

桂枝茯苓胶囊主要由桂枝、茯苓、桃仁、丹皮、赤芍等5味药物组成。具有活血化瘀、消症散、抗凝血、促进微循环、抗肿瘤等多种功效,现广泛用于保守治疗子宫肌瘤[2-3]。

本实验旨在观察桂枝茯苓胶囊对体外培养人宫颈癌Hela细胞生长抑制作用,从诱导凋亡调控基因角度分析其抑制作用机制,为深度开发利用桂枝茯苓胶囊提供实验依据。

1 主要试剂

桂枝茯苓胶囊:购于康缘药业,国药准字Z10950005,取桂枝茯苓胶囊1颗,溶于90%乙醇溶液中,静置取上清液。水浴加热挥发乙醇,残留物溶于1mL DMSO中,除菌过滤备用。盐酸多柔比星(阿霉素):购于浙江海正药业股份有限公司,国药准字H33021980(溶解成16μg•mL-1)。预染MAKER(12kd-94kd),兔抗人Fas IgG,兔抗人Fas-L IgG,兔抗人Bcl-2 IgG,生物素化羊抗兔IgG ,兔抗人Caspase-3多克隆抗体,生物素化羊抗兔IgG,DAB酶底物显色剂盒,等均购自武汉博士德生物工程有限公司。caspase-3上游引物5′-TTTGTTTGTGTGCTTCTGAGCC-3′;下游引物5′-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3′(400bp),β-actin上游引物5′-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3下游引物5′-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3′(125bp)引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2 实验方法

2.1 人宫颈癌Hela细胞培养与分组

将生长良好的人宫颈癌Hela细胞以1×105•mL-1接种于96孔培养板(每孔200μL)、内置盖玻片的6孔培养板(每孔2mL)、25mL培养瓶内(每孔2mL),37℃、5% CO2孵育24h,形态状况良好的供实验分组。

96孔培养板随机分3组:每组6孔,分别加200μL培养液和10μL生理盐水、200μL培养液和10μL阿霉素、200μL培养液和40μL桂枝茯苓胶囊。37℃、5%CO2继续培养24h供相关检测。

6孔培养板和25mL培养瓶各自随机分成3组,分别加2mL培养液和300μL生理盐水、2mL培养液和300μL桂枝茯苓胶囊、2mL培养液和100μL桂枝茯苓胶囊药,37℃、5%CO2继续培养,24h供相关检测。

2.2 检查项目和方法

2.2.1 MTT检测对人宫颈癌Hela细胞抑制作用将实验组96孔培养板培养液吸净,每孔加入0.5mg•mL-1 MTT 20μL,继续孵育4h,弃MTT液后每孔加DMSO 150μL充分溶解深蓝色结晶,450型酶标仪于波长570nm处测定吸光度(A)值,计算细胞生长抑制率(IR)。IR(%)=[1-(空白对组A值-实验组A值)/(空白对照组A值)]×100%。

2.2.2 免疫组化检测对人宫颈癌细胞Hela的Fas Fas-L BCL-2蛋白表达SABC法:取实验组6孔培养板里盖玻片,0.01MPBS漂洗3次,湿盒内10%中尔马林缓冲固定30分钟,PBS漂洗;H2O2+甲醇(1∶50)浸泡15min,PBS洗去浸泡液;加封闭液室温放置20min,甩去多余的液体;加一抗(Fas、Fas-L、Bcl-2 )37℃培养1h,PBS洗2min×3次,加二抗(生物素化羊抗兔IgG)20℃,20min,PBS漂洗;加SABC(1mL蒸馏水+ABC各一滴混匀),20℃,20min,PBS漂洗。苏木素轻度复染,分别用30%、50%、70%、80%、90%乙醇脱水每次2min、二甲苯透明,显微观察Fas、Fas-L、Bcl-2的表达。

2.2.3 western-blot检测对人宫颈癌Hela细胞caspase-3的表达抽提实验组25mL培养瓶细胞蛋白:加700μL裂解液(含PMSF)冰上裂解30min,经常摇一摇,使细胞充分裂解。收集裂解液体,4℃,12000r/min离心5min,取上清分装Eppendorf管中。Lowry法测定蛋白浓度。

取15μL左右(约含蛋白40μg)SDS-PAGE电泳分离后电转移到硝酸纤维膜。取出膜用5%脱脂奶粉室温封闭2h后,用含 0.05%Tween 20的TBS缓冲液(TBST)漂洗3次,每次 10min,加兔抗人Caspase-3多克隆抗体(1∶1000)4℃孵育过夜,TBST漂洗3次后加相应的生物化素羊抗兔二抗(1∶500),37℃摇床温育2h,DAB显色系统显色,拍照。

2.2.4 RT-PCR检测对人宫颈癌Hela细胞Caspase-3的表达按TRIzol试剂说明书提取实验组25mL培养瓶细胞RNA,紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度,纯度要求为OD260/OD280>1.8,将浓度调整为0.2μg/μL,提取的总RNA进行cDNA合成。

RT-PCR反应条件:混匀后42℃1 h,95℃加热5 min,快速冷却到4℃。反转录所得的cDNA用作PCR反应的模板,-20℃保存备用。PCR扩增反应体系及条件:Caspase-3∶94℃ 5min预变性,94℃45s,52℃45s, 72℃1min,30个循环; 72℃延伸10 min,产物4℃保存[4]。

扩增产物经25 g/L琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析系统进行拍照分析。

2.2.5 DNA Ladder检测凋亡条带按DNA ladder抽提试剂盒说明书提取实验组25mL培养瓶细胞DNA,测定DNA浓度。

取5μL样品加入1μL Loading Buffer,1.5%琼脂糖凝胶电泳75V/cm 电泳45 min,凝胶图像处理系统观察拍照。

3 结 果

3.1 对人宫颈癌Hela细胞生长抑制作用

桂枝茯苓胶囊40μL时对Hela有抑制作用(P

表1 桂枝茯苓胶囊对Hela抑制作用(n=6,±s)

组别用药量ul平均吸光度(A)抑制率(%)

空白对照─2.5730±0.105

阿霉素101.3530±0.179 147.41

桂枝茯苓胶囊400.8596±0.133 1,236.47

注:与空白对照组比较,1P

3.2 对人宫颈癌Hela细胞Fas Fas-L Bcl-2 的表达

免疫组织化学染色显示,空白对照组肿瘤细胞数量多,Fas和Fas-L染成棕黄色较少(见图1、3);桂枝茯苓胶囊组大多数肿瘤细胞的胞质和胞膜均有Fas、Fas-L蛋白阳性表达,呈棕黄色颗粒,多为灶状分布或单个细胞散在分布(见图2、4);Bcl-2蛋白在空白对照组较多肿瘤细胞的胞质和核膜呈阳性表达,阳性细胞多呈灶状分布,少数细胞呈散在分布(见图5);桂枝茯苓胶囊组只有少数细胞质和核膜有Bcl-2蛋白阳性表达,且阳性细胞多散在分布(见图6)。

图1 空白组Fas表达

图2 桂枝茯苓胶囊组Fas表达

图3 空白组Fas-L表达

图4 桂枝茯苓胶囊组Fas-L表达

图5 空白组bcl-2表达

图6 桂枝茯苓胶囊组bcl-2表达

3.3对人宫颈癌细胞Hela Caspase-3的表达

DAB在硝酸纤维素膜上显色后,100μL和300μL桂枝茯苓组都有棕褐色条带,且300μL桂枝茯苓组Caspase-3的条带比100μL桂枝茯苓组条带淡,见图7。

M:32KD Caspase-3;1:预染Mark;2:100μL桂枝茯苓胶囊;

3:300μL桂枝茯苓胶囊;4:300μL桂枝茯苓胶囊

图7western-blot检测Hela细胞capase-3条带

对人宫颈癌细胞Hela Caspase-3的表达PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,约400bp处见到条带,与设计引物相符,300μL桂枝茯苓胶囊药液比150μL和100μL桂枝茯苓胶囊药液条条带要亮。空白对照组mRNA的表达量明显少于以上各组。结果见图8。

M:400bp Caspase-3 mRNA;1:桂枝茯苓胶囊300μL组;

2:桂枝茯苓胶囊300μL组;3:桂枝茯苓胶囊150μL l组;

4:桂枝茯苓胶囊150μL组;5:桂枝茯苓胶囊100μL组;

6:桂枝茯苓胶囊100μL组;7:空白对照组

图8 RT-PCR检测桂枝茯苓胶囊对人宫颈癌细胞Hela Caspase-3的表达

3.4 DNA-Ladder

桂枝茯苓胶囊两个剂量组处理36h后,电泳凝胶处理系统中出现DNA梯带,见图9。

图9 DNA-Ladder检测Hela细胞DNA 凋亡条带

4 讨 论

肿瘤的发生是由于细胞增殖和凋亡失调而导致细胞无限增殖所致。肿瘤细胞凋亡及其增殖抑制成为评估抗癌药物作用能力的重要指标[5] 。

细胞凋亡过程受到一系列相关基因的调节和控制[6]。目前发现与细胞凋亡有关的基因包括Fas、Fas-L、Bcl-2、p53、 Bax、Cmy-c、等[7]。Fas位于细胞膜上,属于TNF受体家族成员,Fas配体与表达Fas的细胞结合即可导致细胞凋亡,以抗Fas抗体与之交联,即可导致典型的细胞凋亡[8]。Bcl-2是凋亡抑制基因,以同源或异源二聚体的形式调节细胞凋亡。细胞凋亡时,内源性核酸内切酶被激活,

该酶切开DNA的核小体连接区,形成若干180～200bp大小或其整倍数的寡核苷酸片段,琼脂糖凝胶电泳时,呈现“阶梯状电泳条带”(即DNA ladder),作为判断凋亡的客观指标之一[9] 。

半胱天冬氨酸蛋白酶(caspase)是细胞凋亡的效应蛋白,caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡的执行者,它广泛分布于各种类型的细胞中。caspase-3在细胞中以无活性的酶原形式存在,激活后列解成有活性的分子量17KD和12KD的亚单位[10-11]。因此通过测定caspase-3的活性推断药物的抗肿瘤作用,本实验western-blot发现300μL桂枝茯苓组caspase-3的条带比100μL桂枝茯苓组条带淡,说明随着药物浓度增加,caspase-3被激活的量增加,这和RT-PCR结果caspase-3 mRNA300μL桂枝茯苓组比100μL桂枝茯苓组条带亮一致。

本实验桂枝茯苓胶囊具有体外抑制Hela细胞生长作用,我们推测这种作用是通过启动细胞凋亡来达到抗肿瘤的目的。

参考文献

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