基于HPLC指纹图谱的不同产地升麻质量评价研究

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[摘要] 建立不同产地升麻药材的指纹图谱。使用Kromasil色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈-0.1%甲酸溶液，梯度洗脱，柱温35 ℃，流速1.0 mL·min-1，检测波长254 nm。提取12个色谱峰作为指纹图谱共有峰，采用相似度评价、聚类分析、主成分分析等方法，对所收集的21批样品进行系统比较与归类。结果确定了12个共有峰，将不同产地的样品分为3类。该法重复性好，简便可靠，可以为不同产地升麻的质量控制和评价提供依据。

[关键词] 升麻；指纹图谱

升麻为毛茛科植物大三叶升麻Cimicifuga heracleifolia Kom.、兴安升麻C. dahurica （Turcz.） Maxim.或升麻C. foetida L.的干燥根茎[1]，主产于四川、青海、陕西、云南、东北等地，是我国传统中药材。升麻始载于《神农本草经》，列为上品，其味辛、微甘，微寒，归肺、脾、胃、大肠经，具有清热解毒、发表透疹、升举阳气的功能，用于风热头痛、齿痛、口疮等。

升麻在全国多个地区均有种植，但不同产地升麻的质量差异有待进一步研究。2010年版《中国药典》一部中，以异阿魏酸的含量作为其质量控制指标，已有研究报道将3种酚酸类成分作为升麻的质量控制指标[2]，对不同产地升麻进行质量评价，但数据处理较为简单。为了进一步研究并揭示不同产地升麻的质量差异，本试验采用指纹图谱结合多种化学计量学的数据处理方法进行分析，进而评价不同产地升麻的质量。

1 材料

日本岛津公司Shimadzu LC-20AB高效液相色谱系统，包括在线脱气机、Prominence SIL-20A自动进样器、SPD-M20A二极管阵列检测器、CTO-20A柱温箱；BS2242S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；RE-52旋转蒸发仪（瑞士步琪）。

异阿魏酸（纯度99%，批号ZL1203089）、阿魏酸（纯度99%，批号ZL1203158）、咖啡酸对照品（纯度99%，批号ZL1202169）均购自南京泽朗医药科技有限公司；甲酸（分析纯，南京化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，美国天地公司）；水（杭州娃哈哈公司）。

升麻药材共21批，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为正品，密封保存于阴凉干燥处。其来源见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱，0～25 min，5%～13% A，25～60 min，13%～18% A，60～88 min，18%～28% A，88～110 min，28%～50% A，110～115 min，50%～60% A，115～120 min，60%～5% A，流速1.0 mL·min-1；测定波长254 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL。

2.2 混合对照溶液的制备

精密称取异阿魏酸、阿魏酸及咖啡酸对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制得每毫升分别含异阿魏酸0.443 mg，阿魏酸0.451 mg，咖啡酸0.439 mg的混合溶液，摇匀，作为对照品储备液。

2.3 供试品溶液制备

取升麻药材粉末约1 g，精密称定，置150 mL圆底烧瓶中，加入75%乙醇20 mL，回流提取3次，每次1 h，滤过，滤液减压蒸干，用80%甲醇溶解并定容到10 mL量瓶中，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验 取6号升麻供试品溶液，连续进样6针，每次10 μL，考察色谱峰保留时间的一致性，结果表明，共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.05%～2.3%，1.24%～2.62%，说明各主要色谱峰保留时间与峰面积基本一致，符合指纹图谱的要求。

2.4.2 稳定性试验 精密吸取6号升麻供试品溶液10 μL，分别在0，2，4，8，16，24 h进行检测，结果表明，共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.05%～2.5%，0.93%～1.22%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取同批号样品6份，按2.3项下方法制备样品，按照2.1项下色谱条件进样测定，结果表明，共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为1.24%～2.62%，1.62%～2.37%，符合指纹图谱的要求。

2.5 样品测定

按2.3项下方法制备21批供试品溶液，分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入到高效液相色谱仪测定，记录色谱图，共获得12个共有峰，通过对照品指认，其中3个共有峰分别为咖啡酸（1号峰）、异阿魏酸（2号峰）、阿魏酸（3号峰），结果见图1。

2.6 指纹图谱的建立及分析

2.6.1 参比峰的选择 在各批次样品图谱中，2号色谱峰（异阿魏酸）分离度较好，为样品所有样品共有，故选择2号峰为参照峰。

2.6.2 指纹图谱的建立及相似度评价 将21批升麻样品色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（国家药典委员会2004A版）》，通过多点校正法对色谱峰进行自动匹配，生成升麻提取物的色谱指纹图谱共有模式，见图2。在分析检验模式下，以S6样品图谱作为参照图谱，进行相似度计算，见表2。结果表明，1，17，19，21号样品的相似度小于0.9，其他产地升麻药材的相似度均在0.9以上。

2.6.3 升麻样品聚类分析 本试验对21批升麻样品的hplc指纹图谱进行聚类分析。其中数据源为共有峰的峰面积，所有的数据经过标准化处理，聚类方法为组间连接法，样品距离度采用欧式距离法，得到样品的聚类分析树状图，见图3。

聚类分析图反应的是各样品的相似程度，样品间的分类距离值越小则样品间的差异越小，反之则越大。当分类距离取8时，21类升麻样品被分为3类，见表3。

2.6.4 升麻样品主成分分析 根据21批升麻样品HPLC指纹图谱中12个共有峰的峰面积，选取峰面积较大的主要共有峰（咖啡酸，异阿魏酸，阿魏酸以及3个未知成分）作为指标，采用SPSS 19.0软件对21批升麻样品主成分分析。以选取的6个主要成分的峰面积为数据源，所有数据经过标准化处理后，分别求得对应于2个最大特征值的主成分PCA1（咖啡酸） 和PCA2（异阿魏酸），以PCA1和PCA2建立坐标系，进行投影即可得到所有样本的PCA平面图，见图4。各样本之间的距离越远相似性越差。平面图显示，21批样品可分为3类。样本10号与其他样本的相似性相对较低；2，3，6，9，12样本间距离较近，说明相似性较高。分类结果见表3，与聚类分析结果一致。

3 讨论

3.1 提取溶剂和方法的考察

对35%，55%，75%乙醇进行考察，以75%乙醇提取的样品色谱峰个数较多，峰面积较大，故提取溶剂选择75%乙醇。对超声和回流2种不同提取方法进行比较，回流提取色谱峰峰面积较大，故选择回流提取方式。同时对提取时间（45，60，90 min）、提取次数（1，2，3次）、提取溶剂用量（20，25，30 mL）进行考察，最终确定上述2.3项下供试品溶液制备方法。

3.2 色谱条件的考察

分别考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液3个流动相系统，结果表明，采用乙腈-0.1%甲酸溶液系统时，各峰的分离度较好，基线平稳，有利于指纹图谱的建立，因此，确定乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相系统。

3.3 检测波长的选择

分别选择220，254，280，310 nm作为检测波长，结果发现254 nm波长下各色谱峰分离度最佳，且各色谱峰均能完好地体现在色谱图上，故选择254 nm作为检测波长。

3.4 色谱柱的考察和优化

分别考察了Kromasil C18，YMC-Pack ODS-A 2根色谱柱分析样品，结果显示，前者所得色谱图信息量大，峰形较好，分离度较好，因此选择其作为色谱柱进行样品进行分析。

3.5 主要共有峰的标定

本研究选取峰面积较大的共有峰1，2，3，4，5，6号作为主要共有峰，其中1，2，3已通过对照品比较分别为咖啡酸、异阿魏酸、阿魏酸。4，5，6号色谱峰通过本课题组前期对升麻的LC-MS分析结合文献研究，确定4号峰（相对分子质量为434）为蜂斗菜酸，5号峰（相对分子质量为448）为升麻酸A或升麻酸B，6号峰（相对分子质量为432）为2-阿魏番石榴酸或2-异阿魏番石榴酸，由于市售没有4，5，6色谱峰的对照品，这些化合物的分离工作本课题组正在进行中。

采用本研究建立的指纹图谱方法，对来自不同产地的21批升麻药材进行研究，结果显示，不同产地升麻药材的指纹图谱有明显的差别，第S10号河北产的升麻单独为一类，其与S2，S3，S6，S12号东北地区样品有着明显的差异，但因物种亲缘关系相近，S10样品形状与其他批次的样品外观无区别，图谱无明显差别，主要化学成分十分接近，原因可能与药材生长过程中受到土壤、气候等环境因素及采收加工过程中很多因素的影响有关，这种在共性特征基础上存在的个体差异是常见的现象。本研究选择指纹图谱中6个主要共有成分为指标，进行主成分分析，能够更全面的反映不同产地升麻的质量，比以咖啡酸、异阿魏酸、阿魏酸作为评价标准更为全面。本试验首次采用指纹图谱结合聚类分析和主成分分析等方法对不同产地升麻进行质量评价，从整体上反映和控制升麻药材的质量，为升麻的质量评价以及临床应用提供了可靠的方法。同时，本研究也发现，升麻的指纹图谱中还有很多成分结构尚不明确，还有待进一步的研究。

[参考文献]

[1] 中国药典. 一部[S]. 2010： 68.

[2] 勒波，刘友平，陈鸿平，等. 升麻提取物指纹图谱研究[J]. 中国中药杂志，2011，36（24）：3475.

Study on quality evaluation of Cimicifugae Rhizoma from different

producing areas by HPLC fingerprint

SHEN Bao-jia1，2，3， QIN Kun-ming1， 2， 3， ZHANG Xing-hai1， LIU Qi-di1， CAI Hao1， 3， LIU Xiao1， 2， CAI Bao-chang1， 2， 3*

（1. Engineering Research Center for Processing Standardization of Traditional Chinese Medicines under State Ministry of

Education， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210029， China；

2. Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Co.， Ltd.， Nanjing 210061， China；

3. Key Laboratory for Processing Standardization of Traditional Chinese Medicines under

State Administration of Traditional Chinese Medicine， Nanjing 201146， China）

[Abstract] To establish a fingerprint for Cimicifugae Rhizoma from different producing areas. Column kromasil （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was employed with acetonitrile-0.1% formic acid solution as the mobile phase for gradient elution. The flow rate was 1.0 mL·min-1， the detection wavelength was 254 nm. Twenty chromatographic peaks were extracted as the common peaks of fingerprint， and 21 batches of samples were compared and classified with such methods as similarity evaluation， cluster analysis and principle component analysis. The results showed 12 common peaks and three categories of samples. The method was so highly reproducible， simple and reliable that it could provide basis for quality control and evaluation of Cimicifugae Rhizoma from different producing areas.

[Key words] Cimicifugae Rhizoma； fingerprint

doi：10.4268/cjcmm20131324