恩拉霉素含量测定方法的改进

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摘要：针对《进口兽药质量标准》1999年版收录的恩拉霉素预混剂含量测定方法中部分检测条件进行了适当的改进，将pH 4.0醋酸盐缓冲液改为pH 7.8的磷酸盐缓冲液，检验用菌株改为金黄色葡萄球菌，培养基改为Ⅱ号pH 7.8的培养基，终浓度由10～40 U/mL改为100～400 U/mL，由振摇30 min改为超声提取90 min。优化了检验条件，使检验结果更精准可靠。

关键词：恩拉霉素；效价测定；微生物检定法

中图分类号：S859.79+6 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2013）06-0015-02

恩拉霉素（Enramycin）是由放线菌（Streptomyces fungicidicus）发酵而得，其包括13个不同种类的17个氨基酸分子和脂肪酸分子所组成的有机碱。其中氨基酸分子构成环状多肽结构，脂肪酸位于多肽结构末端，据其末端脂肪酸种类不同，分为恩拉霉素 A（C107H138Cl2N26O31）和恩拉霉素B（C108H140Cl2N26O31）。恩拉霉素对革兰氏阳性菌有很强的抑制作用，如梭状芽孢杆菌、链球菌、葡萄球菌、肺炎双球菌等革兰氏阳性菌均具有很强的抑制作用。尤其是对梭状芽孢杆菌（Clostridium）作用更加显著。恩拉霉素不同于其他抗生素的是长期使用后不容易产生耐药性，并能促进猪、鸡增重和提高饲料转化率。

目前国内兽药恩拉霉素含量测定方法的依据为中国农业部的1999年版《进口兽药质量标准》。依据恩拉霉素的药理学特点，在实际检测工作中对样品提取、缓冲液及终浓度等检测条件进行优化，建立新的检测方法，使得检测条件更合理，结果更精准。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）试剂及培养基。冰醋酸、醋酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、丙酮、盐酸等试剂均为分析纯。试验用水为蒸馏水。pH 4.0醋酸盐缓冲液按照1999年版《进口兽药质量标准》提供方法配制[1]，pH 7.8的磷酸盐缓冲液按照2010版的《中国兽药典》一部附录抗生素微生物检定法配制[2]。抗生素检定培养基Ⅰ号pH 7.8、Ⅱ号pH 7.8均购于北京海淀中海动物保健科技公司。

（2）菌种及标准品。枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]，金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]来源于中国兽医药品监察所。标准品由武汉兴鼎生物科技公司提供，标示效价为1 216 U/mg。

（3）样品4%的恩拉霉素预混剂由兴鼎生物科技公司提供。

（4）仪器设备。TOMY ES310高压灭菌器，干燥箱，恒温水浴培养箱，ZY-300IV多功能微生物自动测量分析仪，移液枪（最大量程1 000 μL）。

1.2 试验方法

（1）按文献[2]分别制备pH 7.8培养基Ⅰ铺加枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]菌悬液和pH 7.8培养基Ⅱ铺加金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]菌悬液的双碟备用。

（2）精密称取标准品适量，按文献[1]加提取液（丙酮：1mol/l盐酸：水 =35：12：56），制成含1 000 U/mL的备用液，再分别用pH4.0的缓冲液与pH 7.8的磷酸缓冲液制成浓度分别为10、40 U/mL与 100、400 U/mL的两组高低剂量溶液备用。取制备好的1.2（1）中两种双碟，分别滴加这两组高低剂量的溶液，同时滴加上述两种缓冲液做空白对照，（37±1）℃培养。

（3）按文献[1]取本品适量，精密称定样品2.500 0 g，加提取液（丙酮：1mol/l盐酸：水 =35：12：56），制成含恩拉霉素1 000 U/mL的溶液，充分振摇30 min，取上清液，用醋酸盐缓冲液（pH4.0）稀释成终浓度分别为10 U/mL和40 U/mL的溶液；按文献[2]测定3批样品的含量。

（4）精密称定样品2.500 0 g，加提取液（丙酮：1 mol/l盐酸：水=35：12：56）约80 mL，水浴超声40 min，冷至室温，加提取液制成含恩拉霉素1 000 U/mL的溶液，用磷酸盐缓冲液（pH 7.8） 稀释成终浓度分别为10、40 U/mL与100、400 U/mL的两组溶液；菌悬液菌株为金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕，培养基为Ⅱ号pH7.8，其他检测条件不变，按文献[2]方法测定3批样品的含量。

（5）在1.2（4）基础上将样品超声提取时间分别设定为10 、20 、40 、60 、90 min，终浓度为100和400 U/mL的溶液，其他检测条件不变，按文献[2]方法测定3批样品的含量。

2 结果与分析

（1）按文献[1]所载方法，在pH7.8培养基Ⅰ铺加枯草芽孢杆菌菌悬液的双碟上滴加醋酸盐缓冲液（pH 4.0）做为试验空白对照，培养结果产生明显的抑菌圈。滴加的标准溶液高、低浓度形成的抑菌圈平均差值小于1，剂间差异不明显。按改进方法的pH 7.8培养基Ⅱ铺加金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]菌悬液的双碟上滴加pH 7.8的磷酸缓冲液为空白的双碟，培养结果无抑菌圈。剂间高低浓度为10 U/mL和40 U/mL的溶液形成的抑菌圈与文献[1]方法相比稍好，但大小抑菌圈平均差值小于1。剂间浓度为100 U/mL和400 U/mL的溶液形成的抑菌圈大小圈差值大于2且小于3.5，剂间差异较明显（表1）。

（2）按文献[1]和改进方法测样品含量，由表2可见，文献[1]所载方法由于剂间差异不显著，所得抑菌圈数据不符合兽药检验操作规程，检测结果无效。方法改进后可得到较为准确的检验结果。

（3）方法改进后，所使用的超声提取时间对结果的影响见表3。由表3可见，剂间浓度为100 U/mL和400 U/mL，经过超声提取，超声时间对检测结果也有一定的影响，超声提取时间在10～40 min期间，超声时间越长检测结果越高，说明延长超声时间可以充分提取样品。但超声时间超过40 min后特别是到90 min时，提取结果反而下降，说明超声40 min就可完全提取样品。

3 讨论

（1）原方法中所用醋酸盐缓冲液（pH 4.0）在一定程度上抑制方法中枯草芽孢杆菌的生长，使得空白醋酸盐缓冲液（pH 4.0）也能产生抑菌圈。而抗生素微生物检定管碟法的原理是在铺加一定量菌悬液的琼脂平板上，利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。由于抑菌圈的大小与检测结果相关，本法所用的稀释液、缓冲液不能有抑菌或杀灭病菌的作用。而文献[1]所载检测方法使用的醋酸盐缓冲液（pH4.0）影响了恩拉霉素正常的抑菌圈的大小，掩盖了其真实的抑菌作用，使检测结果有误 ，此方法不适用于检测恩拉霉素的效价。而改进后的方法避免了此类问题，所用菌株对恩（下转第 21 页）

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拉霉素敏感，缓冲液对菌株无抑制或杀灭作用。

（2）文献[1]所载检测方法中振摇提取30 min，在实际检测中发现超声更利于提取，且超声时间对其结果有一定的影响，在超声40 min时就可完全提取主药成分，因此采用超声提取要比振摇更能得到真实准确的检测结果。

（3）文献[1]所载检测方法，上碟浓度范围为10 U/mL和40 U/mL。改进后的方法上碟浓度范围改为100 U/mL和400 U/mL，用原方法检测发现使用该浓度范围，即使加菌量减小所形成的抑菌圈依然偏小，达不到文献[2]规定的标准品高浓度抑菌圈直径范围应在18～22 mm的要求，影响结果的准确性。而改进后标准品高浓度抑菌圈直径范围在18～22 mm之间，且大小圈差异明显，符合文献[2]要求，使得检测结果更精准。

参考文献：

[1] 中华人民共和国农业部《进口兽药质量标准》（1999年版）[S].

[2] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典（2010年版一部）[M].北京：中国农业出版社，2011.