棉酚及其衍生物的抗肿瘤效果和生产工艺的研究进展

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摘要：棉酚是一种多酚类化合物，由于它在男性避孕方面有副作用，WHO已禁止其作为人类抗生育药物。近年随着抗肿瘤生物活性的深入研究，它可能成为新的抗肿瘤药物。现从抗增殖，干预信号传导通路，干预能量代谢以及抑制Bcl-2蛋白表达4个方面阐述棉酚的抗肿瘤作用机制，并介绍了国内从棉仁、棉籽毛油和油脚及皂脚等多途径回收棉酚的新方法。

关键词：棉酚，制备，抗肿瘤

中图分类号：S562文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)09-0053-04

棉酚是锦葵科植物棉花的根、茎和种子所含的一种黄色多元酚类有毒化合物。1938年Adams等提出了棉酚醇醛结构，见图1。

棉籽中棉酚含量为0.15%～1.8%。其中，棉籽壳中含0.005%～0.01%，棉仁中含0.5%～2.5%[1]。20世纪60年代研究发现棉酚具有抗生育功能以来，一直用作男性避孕药，但现代医学发现，在避孕的过程中，棉酚经常导致低血钾肌无力症或出现永久绝育，所以，世界卫生组织已经宣布停止将此药物作为避孕药使用。随着生物医学技术的飞速发展，棉酚抗肿瘤作用的研究已成为当今世界医学研究的热点，棉酚产品的市场需求日趋旺盛，价格昂贵。目前，美国西格玛公司出售的用于癌症研究的醋酸棉酚标准品价格已达到999us＄/g，相当于黄金价格的60倍。因此，生产高纯度、高生物活性的药用棉酚已成为企业和研究机构竞争的焦点。

1棉酚的抗肿瘤作用

研究表明，棉酚抗肿瘤作用的机制主要表现在抗增殖、干预信号通路、干预能量代谢和磷脂代谢及抑制Bcl-2蛋白过量表达等方面。

1.1抗增殖

拓扑异构酶可改变DNA拓扑性质，在DNA 生物合成中起重要作用。研究表明，棉酚抑制拓扑异构酶Ⅱ的催化激活和干预拓扑异构酶ⅡDNA复合物形成的稳定性，影响细胞的功能。棉酚降低DNA聚合酶α和β的活性，抑制DNA合成，导致细胞在S期中止，是一种特异的DNA合成抑制剂，较大剂量可抑制细胞分裂[2]。Rb蛋白和cyclin D1蛋白调节细胞由G1期进入S期。磷酸化的Rb蛋白在细胞静止期和G1期通过E2F转录因子促进细胞进入S期。cyclin D1能抑制Rb蛋白作用的失活。乳腺癌细胞系MCF27可以高表达磷酸化的Rb蛋白。Van等[3]报道，棉酚在体外和体内对乳腺癌均有明显的抑制作用，其作用机制是影响调节细胞周期的Rb蛋白，从而影响肿瘤细胞生长、诱导其凋亡。章劲夫等[4]在研究中发现，醋酸棉酚在50~300μmol/L浓度范围内，能有效抑制T24膀胱癌细胞的生长。流式细胞仪检测结果表明，棉酚对膀胱癌的增殖有抑制作用，其主要机制之一是诱导癌细胞凋亡。姜劲迈等[5]研究结果表明，棉酚可能是通过直接作用于细胞器，抑制癌变细胞的细胞周期调控因子的表达，抑制rDNA的转录活性，以及抑制细胞增殖酶活性和增强细胞分化酶活性等多个环节抑制细胞增殖，促进细胞分化，从而起到抗癌的作用。

1.2干预信号传导通路

1.2.1干预第一信使激素是信号传导通路中重要的第一信使。组织的生长、发育受激素的控制，组织癌变时，往往会部分保留与原组织相似的激素依赖性。棉酚可改变体内激素水平，阻断异常的信号传导，控制肿瘤的生长。陈静坤等[6]临床应用棉酚治疗子宫肌瘤，用药前后血雌激素水平有显著差异，故认为棉酚可能抑制卵巢功能促使血雌二醇浓度下降，局部组织的浓度也下降，肌瘤缩小。

1.2.2干预第二信使蛋白激酶是一类使蛋白质磷酸化的酶，蛋白激酶、磷酸酶信号传导系统是细胞外信息向细胞内传递的主要机制和最后通路。棉酚干预蛋白激酶的功能，调控信号传导通路，调节细胞的增殖和分化，阻止肿瘤发生和发展。研究表明，棉酚作用于蛋白激酶C（PKC）催化区域的ATP结合部，作为非特异的PKC抑制剂作用于HL260白血病早幼粒细胞系6 h后，凋亡的DN段增多，并有浓度依赖性。实验表明，棉酚抑制鸟氨酸脱羧酶激活的PRL刺激的细胞分裂，降低氚-胸腺密啶核苷（3H-Tdr）掺入DNA 的比例，导致DNA合成下降和抑制细胞分裂。棉酚的抑制浓度与其它PKC抑制剂相符[7]。

1.3干预能量代谢和磷脂代谢[8]

棉酚能抑制细胞能量代谢, 通过乳酸脱氢酶（LDH）同源酶Ⅴ型抑制线粒体氧化磷酸化和电子传递。艾氏腹水瘤细胞和肉瘤180细胞中加入棉酚，观察磷酸肌酸（PCr）、无机磷（Pi）。三磷酸腺苷（ATP），发现ATP/Pi 及PCr/ATP 均下降，表明棉酚有阻断细胞能量代谢的作用。Hutchinson 提出，棉酚可引起磷酸单脂、双脂水平下降及辅酶Ⅰ、Ⅱ上升，抑制细胞能量代谢。超微结构研究表明，棉酚引起线粒体肿胀，嵴断裂、固缩、严重空泡化及溃破等。而线粒体是细胞呼吸、能量供应和氧化、磷酸化的重要细胞器，所以线粒体损伤导致细胞死亡。

1.4抑制Bcl-2蛋白的过度表达

Bcl-2基因是重要的原癌基因，是近年发现的一类凋亡抑制基因，其主要作用机制是在细胞正常增长的情况下，Bcl-2过度表达抑制细胞凋亡，延长细胞寿命，促进细胞生存，从而引起细胞异常积累，增加细胞其他基因突变机会或使突变基因在细胞内集聚，导致细胞恶性转化。此外，肿瘤细胞数为肿瘤细胞分裂增值数减去肿瘤细胞死亡数的动态平衡，Bcl-2通过抑制细胞凋亡，增加肿瘤细胞数，导致肿瘤的发展。

美国科学家[9]利用计算机辅助技术，将三维数据库中的206 876种有机化合物与Bcl-2的BH3结合位点作用，筛选出35种可能的小分子抑制剂，经测试7种具有Bcl-2约束亲和力，其中包括天然小分子化合物棉酚。Zhang等[10]研究显示，棉酚通过调节半胱天冬酶依赖性和半胱天冬酶非依赖性细胞凋亡通路诱导人类PC-3前列腺肿瘤细胞凋亡，这主要是因棉酚抑制了BCL-XL/BCL-2和Bim、Bax形成二聚体，从而促进肿瘤细胞迅速凋亡。美国密西根大学Geldof等[11]和Xu等[12]分别研究了棉酚和左旋棉酚对前列腺癌、脑癌和颈癌的抑制作用，研究发现，在Bcl-2、Bcl-XL、Bax的肿瘤模型中，左旋棉酚明显地增强了肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感度，同时促进了细胞进入G1期。研究进一步证实，棉酚在治疗肿瘤过程中包含Bcl-2抗细胞凋亡通路，也表明棉酚将可作为一种极具潜力的放疗敏感型肿瘤治疗药物。目前，此药物已经获得FDA批准正式进入临床试验。

2棉酚的制备

棉酚常见的3种同分异构体中，醇醛型结构的棉酚最不稳定。主要是因为其中有游离醛基，容易接触空气发生氧化，进而降低棉酚的药用活性。所以，在棉酚生产的过程中，经常用冰醋酸和棉酚形成更稳定的醋酸棉酚配合物，有利于药物的保存和运输。根据生产棉酚的原料差异，其制备方法可分为棉仁法、棉油法和油脚及皂脚法。

2.1棉仁提取法

用棉仁提取棉酚时，应先除去其中的油脂，再用甲醇[13]、乙醚、丙酮或氯仿等有机溶剂提取。通常用六号轻汽油、石油醚等脱脂，得到脱脂棉仁，具体的提取过程如图2所示：

戴卫东等[14]用丙酮、正己烷和水的混合溶剂从棉仁饼中成功地脱除了棉酚，提高了棉粕的质量，增强了棉籽蛋白的食用性，同时利用脱酚后的粕生产出的毛油颜色浅且易精炼。

邵仕香等[15]报道用微波加热回流技术从棉仁中提取棉酚的新方法。将破碎的棉籽用溶剂浸泡后，再用改造的微波炉回流装置微波辐射，其提取液经中和、醋酸化、浓缩及重结晶得到微黄色醋酸棉酚结晶。结果表明，以丙酮-水（4:1）为溶剂，微波功率为630 W，微波辐射6 min，时间仅为传统的索氏提取法的1/25，且提取率较高。

2.2棉油提取法

徐世江等[16]考虑到棉酚是一种强酸不溶于水，其钠盐易溶于水的特点，发明了碱提酸沉棉酚的新方法，同时精炼了棉籽毛油。此工艺首先用pH 9~ 10.5的碱性缓冲液处理冷榨粗棉油，形成可溶于水的棉酚盐，再用稀盐酸沉降棉酚，然后使用乙醚提取棉酚，最后加冰醋酸结晶得醋酸棉酚。

2.3棉油油脚、皂脚提取法

油脚和皂脚是现代油脂精炼过程中的副产物，由于常呈现黄褐色，散发出刺鼻的气味，所以经常被当作废物处理，在一定程度上污染了周围环境。然而，油脚和皂脚中经常含有浓度较高的棉酚，所以利用它们生产棉酚不失为一种合适的原料。

丁骁等[17]描述了从棉油水化油脚中提取棉酚的新方法。先将含5%棉酚的18 kg毛棉油水化油脚用含0.4 mol/L磷酸的84%丁酮80 ℃回流2 h；水解液冷却至室温后，静置分层，上层返回使用；下层用5 L丁酮水溶液恒沸混合溶液洗涤5次，合并洗涤物浓缩，所得丁酮-水溶液留作下次使用；最后向浓缩液中加入35% （V/V）的冰醋酸，搅拌后静置1～2 h结晶棉酚，并减压抽滤棉酚晶体，45 ℃真空干燥5 h, 即得醋酸棉酚，回收率为45%。

Dowd 等[18]已成功地从棉籽油皂脚中提取了醋酸棉酚。含棉酚3.7%的棉籽油皂脚在一定温度下用酸性甲乙酮处理，水解结合态的棉酚，冷却后，棉酚分散于有机相和水相中。移去甲乙酮的有机相，水相再加入甲乙酮提取其中所含的棉酚。浓缩甲乙酮溶液，加入冰醋酸生成醋酸棉酚，冷却结晶后可得纯度87%的醋酸棉酚，回收率63%。所得粗棉酚经重结晶精制后纯度可达99%，回收率58%。笔者用超声波辅助提取和结晶技术成功地从棉油皂脚中提取了棉酚，并将工艺申请了中国发明专利。使用此法使棉酚的初次提取物含量最高达到96%，减轻了重结晶工序中的压力，也使国内棉酚的生产成本大大降低。

3展望

棉酚主要来源于天然植物棉籽，对人和牲畜都有严重的毒性，所以棉籽产品在食用时要先脱除棉酚。过去棉酚仅作为男性避孕药使用，随着世界卫生组织禁令的颁布，棉酚的传统市场急剧萎缩。然而，近年科学家对棉酚的抗肿瘤机制进行了深入探索，同时广泛用于治疗多种肿瘤。我们相信，棉酚作为一种新型的小分子抗肿瘤药物将刺激新的市场需求，带动棉酚走向高端市场。我们认为，在棉酚制备过程中除了重视纯度外，更应注重从消旋棉酚中分离出左旋棉酚及对棉酚结构的修饰以增强其作用效果，这也将是笔者的后续研究工作。

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