水稻蛋白质组研究进展
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摘要：水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物，是人类获得植物蛋白质的主要来源之一。近年来，水稻蛋白质组学发展异常迅速，取得了非常显著的成绩。综述了国内外学者对水稻组织器官蛋白质组、亚细胞水平蛋白质组、逆境胁迫下的蛋白质组、激素诱导下的蛋白质组以及水稻突变体蛋白质组的最新研究进展。
关键词：水稻（Oryza sativa L.）；蛋白质组；双向电泳；质谱
中图分类号：S511；Q71 文献标识码： A 文章编号：0439-8114（2013）10-2233-05
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，为全世界超过2/3的人口提供主食[1]。水稻的基因组较小，由430M个碱基组成，重复序列少，易于遗传操作且与其他禾谷类作物存在共线性，目前已成为单子叶植物分子生物学研究领域的模式生物[2]。2002年水稻栽培品种籼稻和粳稻基因组框架图绘制完成，2005年8月，国际水稻基因组测序计划（IRGSP）已经构建了水稻基因组的框架图，完成了水稻基因组95%高通量序列的测序工作[3，4]。
随着基因组研究的进一步深入，人们认识到单纯进行基因组研究已不能完全解释生命现象的本质问题[5]。水稻从基因组时代步入后基因组时代，注重于功能的研究[6]。传统的基因组功能研究方法主要有基因表达系统分析、微阵列法、基因芯片等，但这些方法都局限于研究mRNA在组织细胞中的丰度变化。事实上mRNA受转录调控的局限，并不能完整描绘蛋白水平上的变化[7]。而蛋白质组是动态的，能通过分离、鉴定和分析细胞、组织或生物体复杂的蛋白混合物来研究目的基因在不同时间是否表达、表达量有无变化、蛋白质不同修饰及亚细胞分布等[8]。因此蛋白质组学研究对后基因组的发展是不可或缺的。
双向电泳和质谱技术是蛋白质组的核心研究工具[9]。通过双向电泳获得蛋白质组表达谱或差异蛋白，再通过质谱技术对感兴趣的蛋白点进行鉴定。通过分析各种蛋白质的结构和功能可以直接研究细胞、组织或生物体在不同生理过程或逆境条件下的变化机制。目前，水稻蛋白质组学主要集中在对水稻各个组织器官及亚细胞水平基本表达模式的研究，同时水稻环境胁迫应答过程的比较蛋白质组学和水稻突变体、激素诱导的蛋白质组学研究也正在进行并逐步深入。
1 蛋白质组学在水稻研究中的应用
1.1 水稻组织器官的蛋白质组
水稻蛋白质组早期的研究主要集中在对各个器官组织进行蛋白质表达谱的研究，以构建水稻蛋白质数据库，确定一些基因在水稻不同发育阶段和不同组织器官表达的特异性。近年来，随着水稻全基因组测序工作的完成，运用蛋白质组学方法可以更加快速、全面地研究水稻的生长发育过程及其调控。
Tsugita等[10]对水稻9种组织和1个器官的蛋白质进行了双向电泳分离，并对分离后的蛋白点根据其等电点、分子量和N端测序作了定性。Woo等[11]对水稻胚乳蛋白质组进行了分析，共获得700个蛋白点，并对其中的100个蛋白进行测序，确定了31个蛋白的N端序列，其余69个蛋白的序列不能确定，推测可能是由这些蛋白的N端封闭造成的。
Kerim等[12]利用蛋白质组的方法研究水稻花粉在发育过程中蛋白质合成的变化。该研究构建了6个不连续的孢子发育阶段的蛋白质表达谱，共获得2 500个蛋白点。比对后发现超过155个蛋白点有2倍以上的丰度变化，155个蛋白点质谱鉴定结果表明，除10个没有获得质谱数据蛋白点外，鉴定的蛋白中有将近一半的蛋白在花粉发育的早期阶段均不表达。
Islam等[13]研究了水稻成熟叶片的蛋白质组，该研究以水稻2月龄叶片和5月龄叶片作为试验材料，比较了水稻叶片蛋白质组在这2个时期的变化。经比对发现仅有5个差异表达的蛋白，同源性搜索鉴定它们为核酮糖二磷酸羧化酶长链前体、光合体系Ⅱ放氧复合体蛋白前体、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、核酮糖二磷酸羧化酶大亚基前体和假定蛋白。
在水稻乳熟期，上位节间对种子质量和产量起着至关重要的作用，Yang等[14]运用蛋白质组的方法分析了水稻乳熟期上位节间的所有可溶性蛋白。通过双向电泳共检测到762个蛋白点，对其中的132个高丰度蛋白点进行质谱鉴定，鉴定出98个蛋白点，对应80个基因的表达产物。这些蛋白属于11个功能类别，与能量相关蛋白排在首位，其他蛋白大部分与代谢、信号转导和抗逆性有关，表明水稻上位节间具有很高的生理活性和抗逆性。Yang等[15]比较了水稻萌发种子和干种子的蛋白质组差异，共发现148个差异表达的蛋白点，其中63个蛋白下调表达，69个蛋白上调表达。下调蛋白主要是贮藏蛋白、与种子成熟相关蛋白及与干燥作用相关蛋白。贮藏蛋白的降解主要发生在萌发阶段Ⅱ的后期（吸涨48 h），与种子成熟和干燥相关蛋白的降解主要发生在萌发阶段Ⅱ的早期（吸涨24 h）。除了α-淀粉酶以外，上调蛋白主要涉及糖酵解途径，例如UDP-葡萄糖脱氢酶、果糖激酶、葡萄糖磷酸变位酶和丙酮酸盐脱羧酶。通过该试验结果可以推测水稻种子萌发过程中可能的生理生化过程。
Shao等[16]选择水稻幼苗2～5叶期4个时期的叶片作为试验材料来研究叶片蛋白质组在幼苗阶段的变化。通过2-DE分离和Imagemaster 2D Elite 5.0软件分析，共检测到41个差异表达蛋白，17个是在3叶期后新出现的蛋白，其中9个蛋白点只出现在3叶期。在41个差异表达蛋白中，有13个蛋白点的表达量呈现先增后减的趋势，直至最后消失。另外的11个蛋白点中，有3个蛋白点表达量下降，6个蛋白点表达量增加，还有2个蛋白点的表达量在2叶期后呈不规则变化。随后，作者对这41个蛋白点进行了质谱鉴定，共鉴定出15个蛋白点，归为4类：涉及光合作用的蛋白、防御相关蛋白、代谢相关蛋白和氨基酸合成代谢蛋白。该研究发现，叶片蛋白上调的关键时期是3叶期，水稻植株可能从这一时期开始由异养阶段转为自养阶段，开始进行光合作用。
He等[17]研究了水稻萌发种子的蛋白质组，进而根据鉴定的蛋白构建水稻种子在萌发过程中的代谢及调控途径。该研究共鉴定出673个不同的蛋白。到目前为止，这是水稻萌发种子最全面的蛋白表达谱。所有蛋白按功能可以归为14类。代谢蛋白为第一大类，共有203个蛋白，占总数的37.6%；第二大类是与发育相关的蛋白，包括贮藏蛋白，大约占总数的25.9%；第三大类包含120个蛋白，涉及蛋白质生物合成、修饰、降解、折叠和运输。其他功能蛋白类别包括信号（42个）、应激反应（41个）、RNA（27个）、DNA（17个）、氧化还原调控（25个）、转运（18个）、细胞（18个）、其他酶类（20个）、激素（9个）和金属处理（4个），另外还有94个蛋白为未知功能蛋白。
1.2 水稻亚细胞水平蛋白质组
随着研究的深入，人们不再把目光仅局限于水稻组织器官水平上的蛋白质组研究，而是深入地研究水稻亚细胞水平的蛋白质组。对水稻进行亚细胞水平上的蛋白质组研究，有助于丰富水稻蛋白质数据库，为以后蛋白的鉴定奠定基础。
Tsugita等[10]首先对水稻叶绿体进行了蛋白质组分析。经2-DE分离共检测到276个蛋白点，对16个蛋白进行了N-端序列分析，并对13个蛋白进行了测序分析。这是首次对水稻叶绿体蛋白质组分析的报道，提供了水稻叶绿体蛋白的概况。Heazlewood等[18]对水稻线粒体蛋白质组进行了研究，经双向电泳共分离到250个蛋白点，并对其中145个高丰度蛋白进行了质谱分析，共鉴定出80个蛋白，预测由63个基因表达所得。
Aki等[19]通过分析水稻细胞白质组以期发现在植物糖类应答中起保守进化作用的新蛋白。最初运用纳升级液相色谱—串联质谱法获得了563个差异点，通过DNA亲和层析发现，307个差异点与核酸有关，经生物信息学筛查最终确定了2个新蛋白。该研究不仅提高了我们对白的认识，还提供了一种鉴定个别特殊因子的新方法。Tan等[20]为了研究水稻染色质的构成蛋白和高级结构，提取水稻悬浮细胞的染色质蛋白，经二维电泳获得972个蛋白点，随后对这些蛋白点进行质谱分析，共鉴定出509个蛋白点，对应269种蛋白。对染色质纯化蛋白进行鸟枪法分析发现，除4种常见的核心组蛋白外还鉴定出许多组蛋白变体。其他鉴定出的蛋白包括核小体组装蛋白、高迁移率蛋白、组蛋白修饰蛋白、转录因子还有许多假设或功能未知的蛋白。
1.3 逆境胁迫下水稻蛋白质组
在水稻生长过程中往往会受到来自各方面的胁迫，有生物胁迫也有非生物胁迫。在各种胁迫情况下，水稻植株总会产生许多应激反应，然而对于这些应激反应的机制却知之不多。蛋白质组方法的诞生为研究这些应激机制提供了便利，可以通过水稻在不同胁迫下产生的蛋白表达变化，分析不同胁迫对水稻的伤害机制及水稻对不同胁迫的适应机制。
Agrawal等[21]运用双向电泳、氨基酸测序和免疫印迹技术首次研究了臭氧对水稻幼苗的影响。与对照相比共找到了52个差异表达的蛋白点，臭氧处理使得水稻叶片中的光合作用蛋白急剧减少，同时诱导许多与防御相关蛋白的表达。研究还发现，许多叶片中突出变化的蛋白都发生在臭氧处理后的24 h之内，诱导了与发病机制相关的蛋白、抗坏血酸过氧化物酶、超氧化物歧化酶、钙结合蛋白等蛋白的表达。
Ventelon-Debout等[22]通过双向电泳和质谱鉴定技术研究了水稻在水稻黄斑病毒感染期间的蛋白表达谱。该研究选取了2个水稻品种作为试验材料，一个是易感染水稻黄斑病毒的IR64，另一个是对水稻黄斑病毒有一定抗性的Azucena。通过比较对照和病毒感染细胞的蛋白质组，在IR64的表达谱中变化显著的蛋白点有40个，而在Azucena的表达谱中变化显著的蛋白点有24个。对这些点进行质谱鉴定，2个品种分别鉴定出19个和13个蛋白。这些蛋白属于3大功能类别：新陈代谢相关蛋白、胁迫相关蛋白和翻译相关蛋白。
Kim等[23]选用液体培养18 d的水稻幼苗作为试验材料，用盐溶液处理3 d后比较水稻蛋白质组的变化。比较对照组和处理组的水稻叶片蛋白表达谱，一共得到55个差异表达蛋白，其中有47个蛋白点在盐处理后表达上调。随后用纳升级液相色谱-串联质谱法对这些蛋白点进行鉴定，共鉴定出33个蛋白点。鉴定的这些蛋白多数参与主要的代谢过程，例如二氧化碳同化和光呼吸作用。此外，双向电泳免疫印迹和酶活测定结果显示关键的标记酶的显著变化与盐胁迫氧化损伤有关。
Yan等[24]为了研究水稻在低温胁迫下的应激反应，对3周龄水稻幼苗分别在6 ℃处理6 h和24 h，随后恢复24 h，再通过双向电泳技术研究水稻叶片中蛋白质的变化。对凝胶进行分析共得到31个下调蛋白和65个上调蛋白。通过质谱鉴定了85个差异表达的蛋白，涉及多种生理过程，包括信号转导、RNA加工、翻译过程、蛋白质加工、氧化还原平衡、光合作用、光呼吸作用，还有碳、氮、硫和能量代谢。
Fan等[8]选取2周龄水稻幼苗作为试验材料，分别用绵羊唾液处理2、6、12和24 h，通过蛋白质组方法研究了水稻幼苗对绵羊唾液胁迫的反应。定量分析表明，经绵羊唾液处理后共有54个蛋白点的表达量发生了变化，19个蛋白点在处理2 h时发生变化（19个蛋白点中有1个在6 h和12 h时同样发生变化，还有2个蛋白点分别在12 h和24 h时发生变化）；7个蛋白点在处理6 h时发生变化；16个蛋白点在12 h时发生变化（16个蛋白点中有1个在24 h时同样发生变化）；16个蛋白点在处理24 h时发生变化。上述54个蛋白点通过质谱鉴定出37个，根据功能将它们分为8类。有许多蛋白参与复杂的代谢途径，例如过氧化氢酶、过氧化物氧化酶、ATP合酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和核酮糖二磷酸羧化酶。
低浓度的亚硒酸钠对水稻幼苗的生长有促进作用，高浓度的亚硒酸钠会抑制水稻幼苗的生长。为了研究硒引起这些反应的详细调控机制，Wang等[25]运用双向电泳和质谱技术进行了比较蛋白质组研究。分别用3种不同浓度硒对水稻幼苗和根进行处理，与对照相比分别得到66个和97个差异表达蛋白（3种处理浓度的总和），表明根比幼苗对硒处理表现出更为敏感。在这些差异点中，在3种浓度处理下都上调的蛋白点在苗和根中分别有8个和24个，在3种浓度处理下都下调的蛋白点在苗和根中分别有48个和46个，苗和根中分别有7个和17个蛋白点在低浓度处理下是上调的，但在高浓度处理下又发生了下调。此外，苗和根中分别还有3个和10个蛋白点在低浓度处理下是下调的，在高浓度处理下反而上调。经质谱完全鉴定，66个苗蛋白差异点鉴定为54种蛋白，97个根蛋白差异点鉴定为80种蛋白，其中只有7个蛋白均在苗和根中出现。Gene ontology和分类分析表明，初级代谢、光合作用和氧化还原平衡是最容易受硒处理影响的生理过程。低浓度的硒处理能活化抗氧化体系，增强光合作用和初级代谢作用。高浓度的硒处理会损伤光合作用装置，抑制光合作用和初级代谢。
1.4 激素诱导下水稻蛋白质组
激素在水稻的生长发育过程中起着不可忽视的调控作用，运用蛋白质组学技术研究激素对水稻的调控作用可以通过蛋白表达的变化来推测激素对水稻生长发育调控的作用机制。
Shen等[26]研究了水稻叶鞘经5μmol/L赤霉素处理不同时间后的蛋白表达情况，经2-DE分离和计算机图像分析，共检测到33个差异表达蛋白，其中21个蛋白点表达上调，12个蛋白点表达下调，说明水稻叶鞘经赤霉素处理至少有30多个基因产物与之相关。Rakwal等[27]研究了水稻各组织中受赤霉素调控的蛋白。作者分别研究了水稻叶鞘、根和悬浮细胞经赤霉素处理前后的蛋白表达情况，叶鞘、根和悬浮细胞中分别获得79、73和140个差异表达蛋白，这些蛋白点中分别鉴定出8、21和14个受赤霉素调控的蛋白。这些蛋白在叶鞘中参与一般的新陈代谢、能量产生、转录调控和信号转导，在根中参与代谢和防御作用，在悬浮细胞中参与代谢、能量产生、细胞生长、防御和信号转导。
Tanaka等[28]在蛋白质组水平上研究了外源的脱落酸对2周龄水稻幼苗叶片的影响。从叶片蛋白脱落酸处理前后蛋白表达谱上来看，脱落酸处理后的蛋白点与对照相比有显著差异，共检测到36个差异蛋白点。氨基酸序列分析表明，脱落酸主要引起光合蛋白、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶和一些防御蛋白的剧烈变化。Kim等[29]研究了赤霉素和脱落酸在种子萌发过程中所起的作用，经蛋白质2-DE图谱分析后得到16个受赤霉素或脱落酸显著调控的蛋白，15个蛋白点经赤霉素处理后表达上调，1个蛋白点经脱落酸处理后表达下调。这些经赤霉素处理增加而经脱落酸处理后又减少的蛋白被视作赤霉素反应蛋白。Zhang等[30]为了验证脱落酸是否在劣质子粒灌浆期中起重要作用，采用基于双向电泳的比较蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学来研究劣质子粒经外源的脱落酸处理后蛋白表达的变化。试验总共检测到111个显著差异的蛋白和31个磷蛋白。经质谱鉴定的蛋白和磷蛋白分别有100个和23个。这些差异表达的蛋白在防御、次级代谢以及细胞发育和光合作用中起着作用。
1.5 水稻突变体的蛋白质组
突变体是遗传学研究的重要材料，应用蛋白质组学方法对基因突变引起的蛋白质表达变化进行研究，可直观地将差异表达的蛋白呈现出来，有助于揭示突变体的生理生化及遗传机制，从而得到植物遗传学的重要数据。
Komatsu等[31]比较了水稻绿苗和白化苗的蛋白质2-DE图谱，发现参与光合作用的蛋白质只存在于绿苗中，而白化苗中仅以此蛋白质前体的形式出现。抗坏血酸过氧化物酶只存在于白化苗中，说明抗氧化酶在水稻白化苗中起细胞保护的作用。王玉忠等[32]比较了温敏失绿突变体水稻失绿前后的2-DE图谱，发现失绿部分某蛋白P1特异缺失，在复绿后P1正常表达，推测该蛋白与叶绿素代谢密切相关。温敏核不育水稻是两系核不育水稻的重要育种材料，低温下可育。谢锦云等[33]对不育和可育花药样品通过2-DE图谱分离，发现从不育到可育的2-DE图谱上，明显上调的蛋白质包括几丁质酶、酸性磷酸酶、谷蛋白前体等，明显下调的蛋白有谷氨酸氨甲酰转移酶等。模拟病斑突变体通常能在无病原物存在的情况下产生系统性过敏性坏死斑，并表现出对多种病原物抗性的提高。
Tsunezuka等[34]对一种cdr2突变体的3个病斑形成阶段材料用2-DE分离，与野生型相比，有37个蛋白点差异表达，其中28个蛋白点在突变体中表达上调，9个蛋白点表达下调，经质谱鉴定，差异表达的蛋白点与防御作用相关。此外代谢酶类蛋白有27个，暗示该突变体发生的细胞程序化死亡与活跃的代谢有关。Chen等[35]用蓝绿胶和2-DE的方法对水稻黄绿突变体中叶绿体类囊体膜上的蛋白复合物进行了分离，共鉴定了52个蛋白点。欧立军[36]研究了温敏核不育水稻淡黄叶突变体安农810 S的叶绿体蛋白，发现突变体的叶绿体蛋白约为对照安农810 S的55%，经质谱鉴定，与光合作用相关的差异蛋白点有13个，其中4个缺失蛋白，包括1个RuBP大亚基缺失。
2 前景和展望
水稻蛋白质组学作为一门新兴的学科已经受到越来越多的关注。目前水稻蛋白质组学已经从组织器官、亚细胞水平、逆境胁迫、激素诱导、突变体等方面进行了研究，并在蛋白鉴定和功能分析方面取得了巨大进展，已建立了一些水稻蛋白质组的数据库，包括各组织器官、亚细胞及不同发育期的双向电泳图谱。另外，水稻的逆境胁迫和激素的蛋白质组学研究有利于提高水稻的品质、产量。但是水稻蛋白质组的研究还停留在一个比较基础的层面上，大多数研究都只局限于一种组织、一种处理，单一地研究水稻生长、发育、代谢调控机制，并没有从系统的角度来看待这一问题，在代谢途径、调控网络方面的研究还有所欠缺。
随着各种数据库的不断丰富，生物信息学的发展，质谱等高通量支撑技术的改进，以及大规模水稻功能基因组的研究，将有利于实现水稻蛋白质数据库和与其基因组数据库的整合，这有助于实现诸如水稻生长、发育、进化及代谢调控等生命活动规律等方面的重大突破，有助于人们整体理解作为重要农作物的水稻。另外，水稻的蛋白质组学研究也为其他禾谷类农作物的功能基因组研究打下了坚实的基础。
总之，2-DE在目前的蛋白质分离科学中仍然占有很重要的地位，与其他具有快速、高通量特征的方法相互补充将是当前及未来相当长时间内研究蛋白质组的一种趋势。随着蛋白质组学研究的不断深入，蛋白质组学的规模和研究关注的焦点在不断改变，需要发展生物计算机技术来整合蛋白质组的巨大数据并用以描述复杂生物系统，蛋白质组学研究的重点将从蛋白表达转向蛋白功能研究。与此同时，完整的水稻蛋白质组学还要深入研究蛋白质翻译后修饰（PTMs）以及蛋白质之间相互作用复杂的网络关系，这是蛋白质组学研究的一项艰巨任务，也是今后研究的重点。
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