旋覆花中化学成分及其活性研究

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇旋覆花中化学成分及其活性研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

[摘要] 综合运用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、制备HPLC色谱分离方法分离纯化旋覆花中的化学成分，采用NMR和质谱等有机波谱学方法鉴定各单体化合物的结构，进一步测试各化合物的抗炎活性。从旋覆花乙酸乙酯提取物中分离得到15个化合物，鉴定为二氢芥子醇（1），（3S，5R，6S，7E）-5，6-epoxy-3-hydroxy-7-megastigmen-9-one（2），（6R，7E）-9-hydroxy-4，7-megastigmadien-3-one（3），阿里二醇（4），蒲公英醇乙酸酯（5），8，9，10-三羟基百里香酚（6），花旗松素（7），木犀草素（8），泽兰黄酮（9），泽兰黄醇素（10），菠叶素（11），槲皮素（12），对羟基桂皮酸（13），咖啡酸（14），咖啡酸乙酯（15）。化合物1，2，7，13，15为首次从该属植物中分离得到，化合物3， 4，9～11，14为首次从该种植物中分离得到。抗炎活性测定结果表明，化合物3，6～12，14具有明确的抑制c-Kit Ligand（KL） 诱导的肥大细胞白三烯C4 （LTC4） 生成和脱颗粒的作用，而且化合物8和12具有较强的抑制脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞RAW264.7细胞一氧化氮（NO） 释放作用。首次报道了黄酮类化合物7，9～11对LTC4和肥大细胞脱颗粒具有较强的抑制作用。

[关键词] 旋覆花；化学成分；白三烯；肥大细胞脱颗粒；抗炎作用

[收稿日期] 2013-07-26

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81202542）；天津市自然科学基金项目（13JCYBJC24800）；高等学校博士学科点基金项目（20121202120009）

[通信作者] *金美花， E-mail：；*唐生安， E-mail：

[作者简介] 朱虹， 硕士研究生， Tel：13902069091， E-mail：

《中国药典》2010年版收录的旋覆花为菊科植物旋覆花属旋覆花Inula japonica Thunb.或欧亚旋覆花I. britannica L.的干燥头状花序，作为传统的中草药主要分布在欧洲、非洲及亚洲的中国、韩国和日本[1-2]，以地中海地区为主，在我国有20 余种。目前，国内外学者报道了旋覆花中富含甾醇、倍半萜及黄酮类化合物[3]，药理研究结果表明，旋覆花属植物在抗肿瘤[4-6]、抗炎、抗血脂[7]和护肝、及预防和治疗糖尿病[7]等方面都具有很好的生物活性。本文对河南产旋覆花I.japonica 开展了活性化学成分研究，从中分离得到15个化合物，利用有机波谱技术鉴定其化学结构，分别为二氢芥子醇（1），（3S，5R，6S，7E）-5，6-epoxy-3-hydroxy-7-megastigmen-9-one（2），（6R，7E）-9-hydroxy-4，7-megastigmadien-3-one（3），阿里二醇（4），蒲公英醇乙酸酯（5），8，9，10-三羟基百里香酚（6），花旗松素（7），木犀草素（8），泽兰黄酮（9），泽兰黄醇素（10），菠叶素（11），槲皮素（12），对羟基桂皮酸（13），咖啡酸（14），咖啡酸乙酯（15）。进一步考察了以上化学成分对肥大细胞LTC4生成、脱颗粒及巨噬细胞NO释放的影响。

1 材料

Bruker400核磁共振仪（TMS内标）；液质联用色谱仪：Alliance 2695 Quattro Micro TM ESI（Waters）；半制备高效液相色谱仪：日本分光公司（JASCO）， PU-2089（泵），RI-2031及UV-2075（检测器）；制备HPLC色谱柱：GPC（凝胶渗透色谱柱） Shodex， Asahipak GS-20G（20 mm×500 mm），YMC-Pack ODS-A SH-343-5（20 mm×250 mm）， YMC-Pack S IL-06（ 20 mm×250 mm， 5 μm）；凝胶柱色谱Toyopearl HW-40C（Tosoh）；日本Hitachi UV-3310型紫外-可见分光光度计；柱色谱和薄层色谱用硅胶均系青岛海洋化工厂生产，所用试剂均为分析纯；氘代试剂购自美国Sigma-Aldrich公司。

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞（韩国细胞株银行）；LTC4 ELISA试剂盒（美国Cayman Chemical公司）； KL（加拿大STEMCELL Technologies公司）；LPS（美国Sigma-Aldrich公司）；RPMI-1640，DMEM和胎牛血清（FBS）（美国Hyclone公司）。

旋覆花于2010年采集于河南，经天津医科大学药学院周晔教授鉴定为I. japonica，标本（D20110331） 存放于天津医科大学药学院。

2 方法

2.1 提取与分离 旋覆花干燥头状花序8 kg，用75%乙醇回流提取3次，每次2 h，提取液减压浓缩，提取物（672 g）以水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚提取物（36 g）、乙酸乙酯提取物（117 g）、正丁醇提取物（266 g）。旋覆花乙酸乙酯提取物（117 g），以硅胶柱色谱分离，分别用石油醚-乙酸乙酯（4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2），乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇（95∶5，9∶1，8∶2）梯度洗脱，TLC合并类似组分，得到组分XFH0101-0128。

组分XFH0112经过凝胶（Toyopearl HW-40）柱色谱分离得到5个组分（12.1～12.5）。组分12.3经制备高效液相色谱ODS分离（甲醇-水，7∶3）和制备凝胶渗透色谱GPC（MeOH）纯化，得到化合物1（7.0 mg），2（7.5 mg），3（14.0 mg）。组分12.4进一步经制备高效液相ODS（甲醇-水，6∶4） 纯化，得到化合物10（13.5 mg）。XHF0115经过凝胶（Toyopearl HW-40） 柱色谱分离得到6个组分（15.1～15.6）。组分15.3和15.4分别经制备高效液相色谱（ODS-A，甲醇-水，6∶4；GPC，甲醇） 分离纯化，得到化合物6（9.4 mg），11（55.5 mg）。XFH0111经过凝胶（Toyopearl HW-40）柱色谱分离，经制备高效液相色谱（GPC，甲醇） 纯化得到化合物7（13.4 mg），8（9.1 mg），9（38.7 mg），14（35.3 mg）。组分XFH0114（2.8 g）以凝胶（Toyopearl HW-40） 柱色谱分离，进一步重结晶得到化合物12（300.0 mg）。XFH0109（2.8 g） 经过凝胶（Toyopearl HW-40） 柱色谱分离，进一步经制备高效液相色谱ODS（甲醇-水，8∶2） 和GPC（甲醇） 分离纯化得到化合物4（3.0 mg），5（8.6 mg），13（7.0 mg）。XFH0113（2.2 g） 经过凝胶（Toyopearl HW-40） 柱色谱分离，进一步经制备高效液相色谱 GPC分离得到化合物15（5.0 mg）。

2.2 NO生成的测定 RAW264.7细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基。取对数生长期的细胞（3×105细胞/孔） 接种于24孔板中，待细胞贴壁后加入不同浓度（根据MTT法筛选的无细胞毒剂量） 各种单体化合物孵育1 h，再加入终浓度为200 μg・L-1的LPS刺激24 h。Griess法[8]测定上清中NO的含量。

2.3 LTC4含量和肥大细胞脱颗粒的测定 来源于（BALB/c） 小鼠骨髓的肥大细胞（bone marrow-derived mast cells；BMMCs） 的制备按文献[9]方法，BMMCs培养于含白介素-3（IL-3） 和10%FBS的RPMI1640培养基。BMMCs（2×105细胞/孔） 接种于96孔板中，加入不同浓度（根据MTT法筛选的无细胞毒剂量） 各种单体化合物孵育1 h，再用终浓度为50 μg・L-1的KL刺激15 min后收集上清液。采用ELISA方法检测上清中LTC4的含量；采用分光光度分析法定量β-hexosaminidase（β-HEX） 底物的水解作用，检测β-HEX的释放。

3 结构鉴定

化合物1 无色油状物；ESI-MS m/z 211[M-H]-；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：6.43（1H，s，H-2，6），2.65（2H，t，J=7.6 Hz，H-7），1.88（2H，m，H-8），3.69（2H，t，J=6.4 Hz，H-9），3.88（6H，s，-OCH3）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：133.0（C-1），105.0（C-2，6），147.0（C-3，5），133.0（C-4），32.3（C-7），34.5（C-8），62.3（C-9），56.3（-OCH3）。以上数据与文献[10]报道二氢芥子醇的数据基本一致。

化合物2 无色油状物；EI-MS m/z 224（M+・）；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：7.03（1H，d，J=15.6 Hz，H-7），6.28（1H，d，J=15.6 Hz，H-8），3.91（1H，m，H-3），2.28（3H，s，H-10），1.19（6H，s，H-11，12），1.07（3H，s，H-13）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：35.1（C-1），40.6（C-2），64.0（C-3），46.6（C-4），67.3（C-5），69.5（C-6），142.4（C-7），132.6（C-8），197.5（C-9），28.3（C-10），29.3（C-11），25.0（C-12），19.9（C-13）。以上数据与文献[11]报道（3S，5R，6S，7E）-5，6-epoxy-3-hydroxy-7-megastigmen-9-one的数据基本一致。

化合物3 无色油状物；EI-MS m/z 208（M+・）；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：5.93（1H，s，H-4），5.68（1H，dd，J=15.2，6.0 Hz，H-8），5.53（1H，J=15.2，8.4 Hz，H-7），4.35（1H，m，H-9），2.52（1H，d，J=9.2 Hz，H-6），2.33（1H，d，J=16.8 Hz，H-2a），2.07（1H，d，J=16.8 Hz，H-2b），1.90（3H，d，J=1.2 Hz），1.29（3H，d，J=6.4 Hz，H-10），1.03（3H，s，H-11），0.98（3H，s，H-12）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：36.2（C-1），47.4（C-2），199.3（C-3），125.8（C-4），162.0（C-5），55.4（C-6），126.6（C-7），138.6（C-8），68.3（C-9），23.5（C-10），27.1（C-11），27.9（C-12），23.5（C-13）。以上数据与文献[11]报道（6R，7E）-9-hydroxy-4，7-megastigmadien-3-one的数据基本一致。

化合物4 白色无定形粉末；EI-MS m/z 442（M+・）；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：4.65（1H，d，J=1.9 Hz，H-30a），4.63（1H，d，J=1.9 Hz，H-30b），3.39（1H，dd，J=11.6，4.6 Hz，H-3），3.21（1H，dd，J=11.3，5.0 Hz，H-16）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：38.8（C-1），27.4（C-2），79.0（C-3），38.9（C-4），55.4（C-5），18.3（C-6），34.0（C-7），40.0（C-8），50.0（C-9），37.1（C-10），21.4（C-11），25.9（C-12），38.8（C-13），42.3（C-14），36.1（C-15），77.3（C-16），40.9（C-17），47.7（C-18），39.0（C-19），153.6（C-20），25.0（C-21），35.3（C-22），28.0（C-23），15.3（C-24），16.3（C-25），16.3（C-26），15.9（C-27），12.8（C-28），25.3（C-29），107.4（C-30）。以上数据与文献[12]报道阿里二醇的数据基本一致。

[23] 么焕开， 段静雨， 段宏泉， 等.刺楸化学成分研究[J]. 中药材， 2011， 34（5）：716.

[24] 赵晓宏， 陈迪华， 斯建勇， 等. 中药升麻酚酸类化学成分研究[J]. 药学学报， 2002， 37（7）：535.

[25] 韩树， 张云， 霍阿丽， 等. 忍冬茎叶化学成分的研究[J]. 西北农业学报， 2009， 18（5）：363.

[26] Kitahata Y， Nunomura S， Terui T， et al. Prolonged culture of mast cells with high-glucose medium enhances the Fc epsilon RI-mediated degranulation response and leukotriene C4 production [J]. Int Arch Allergy Immunol， 2010， 152（Suppl 1）：22.

[27] Kimata M， Shichijo M， Miura T， et al. Effects of luteolin， quercetin and baicalein on immunoglobulin E-mediated mediator release from human cultured mast cells[J]. Clin Exp Allergy， 2000， 30（4）：501.

Anti-inflammatory constituents from Inula japonica

ZHU Hong， TANG Sheng-an， QIN Nan， DUAN Hong-quan， JIN Mei-hua

（School of Pharmacy， Research Center of Basic Medical Sciences， Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling

Development Clinical Therapeutics and Diagnostics， Tianjin Medical University， Tianjin 300070， China）

[Abstract] Chemical constituents of Inula japonica were isolated and purifiedby repeated column chromatographies， over silica gel， and Toyopearl HW-40， and preparative HPLC. On the basis of spectral data analysis， including NMR and MS data， the structures of the isolates were elucidated and their anti-inflammatory activities were assayed. Fifteen compounds were isolated from the ethyl acetate extract of I.japonica， and their structures were elucidated as dihydrosyringenin（1），（3S，5R，6S，7E）-5，6-epoxy-3-hydroxy-7-megastigmen-9-one（2），（6R，7E）-9-hydroxy-4，7-megastigmadien-3-one（3）， arnidiol（4）， taraxasterol acetate（5）， 8，9，10-trihydroxythymol（6）， taxifolin（7）， luteolin（8）， napetin（9）， eupatin（10）， spinacetin（11）， quercetin（12）， p-hydroxycinnamic acid（13）， caffeic acid（14）， and caffeoyl acetate（15）. Compounds 1， 2， 7， 13 and 15 were isolated from the genus Inula for the first time， and compounds 3， 4， 9-11 and 14 were isolated from this plant for the first time. The anti-inflammatory activity result showed that compounds 3， 6-12 and 14 exhibited inhibition effect against leukotriene C4 （LTC4） synthesis and degranulation definitely in c-Kit Ligand（KL） induced mast cells， and compound 8 and 12 also had the suppression effect against lipopolysacharide（LPS） induced nitric oxide（NO） activity in RAW264.7 macrophages. It is firstly reported that compounds 7 and 9-11 possessed potent inhibition activities against LTC4 generation and degranulation in mast cells.

[Key words] Inula japonica； chemical constituent； LTC4； mast cell degranulation； anti-inflammatory activity