杠板归不同部位中齐墩果酸和熊果酸含量的测定研究

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关键词 杠板归 齐墩果酸 熊果酸 反相高效液相色谱法 光电二极管阵列检测器 含量测定

杠板归又名河白草、蛇倒退，别名贯叶蓼，为蓼科植物杠板归Polygonum per folia-tum L.的地上部分，具有利水消肿、清热解毒、活血等功效［1］。该植物临床应用广泛，尤其在治疗妇科炎症疾病方面具有独到疗效，目前市场上已有以该植物入药的中成药制剂上市。体内外实验表明，杠板归具有抗癌活性，对实验性动物移植肿瘤有抑制作用，还具有抗炎和抑菌活性［2-3 ］。对其化学成分的研究表明，杠板归全草含黄酮类、苦木素类、蒽醌类和新苯丙素蔗糠酯类化合物［4］；还含齐墩果酸和乌索酸等三萜酸类成分，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血糖血脂等多种生理作用［5-8］。同时测定杠板归中齐墩果酸和熊果酸含量的方法尚未见文献报道。为此，本实验采用超声辅助提取，建立反相高效液相色谱法同时测定了杠板归不同部位中齐墩果酸和熊果酸的含量，为杠板归中齐墩果酸和熊果酸的测定及其开发利用提供科学依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器：Waters系列高效液相色谱仪，包括双515泵，光电二极管阵列检测器(2996型)，77251进样阀，Empower中文色谱数据工作站(美国)；RO-MB-10D高纯水机(杭州永洁达膜分离设备厂)；CP225D电子分析天平(北京Sartourius公司)；FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；202-26A型数显电热恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)；SK2510HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司，功率：250W，频率：59kHz)。

1.2 试剂：甲醇为色谱纯（江苏汉邦科技有限公司），乙醇为分析纯（江西洪都生物化学有限公司），水为超纯水，磷酸为分析纯（上海市试剂一厂综合经营公司），熊果酸、齐墩果酸对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号分别为：110742-200314，110709-200311），杠板归原料药采自福建省，经鉴定为蓼科植物杠板归Polygonum per foliatum的地上部位。

2 方法与结果

2.1 溶液配制：分述如下。

2.1.1 对照品溶液：分别精密称定齐墩果酸、熊果酸对照品1.14mg和2.72mg，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含齐墩果酸0.114mg•ml-1和熊果酸0.272 mg•ml-1的对照品混合溶液。

2.1.2 样品溶液：杠板归按茎、叶和地上部位分离后置恒温干燥箱中于80 ℃干燥6 h，用高速中药粉碎机粉碎。精密称取样品不同部位粉末约3g，分别置于50ml具塞锥形瓶中，加入50ml95%乙醇超声提取45min，冷却后不足损失乙醇重量，摇匀后用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为样品溶液。

2.2 熊果酸和齐墩果酸检测波长的确定：采用PAD检测器在190～600 nm波长范围内扫描，对照品溶液中熊果酸和齐墩果酸在流动相中的最大吸收波长分别为199.9 nm和201.0 nm（图1），但由于在低波长处流动相有较强的末端吸收，为减少干扰，提高信噪比，提取不同波长的色谱进行比较，并积分计算了对应的峰面积响应值，选择210 nm为检测波长，其信噪比高，噪音低，峰形对称，可在消除背景干扰时保证基线平稳和检测的灵敏度。

2.3 色谱条件：色谱柱为Kromasil C18柱（4.6mm×250mm，5 μm）；流动相为甲醇∶水∶磷酸（90∶10∶0.1 ，v/v/v）；流速0.8 ml•min-1；检测波长210 nm；柱温为30℃。以齐墩果酸和熊果酸计，理论塔板数均大于12000，齐墩果酸和熊果酸分离度为1.78，对称因子分别为1.03、1.01，外标法定量分析。对照品和样品色谱见图2～3。

2.4 精密度试验：分别精密吸取对照品混合贮备溶液10μl，平行进样5次，以峰面积计算色谱系统精密度，齐墩果酸和熊果酸峰面积RSD分别为0.6％(n=5)和0.3％(n=5)。说明进样方法和仪器精密度良好。

2.5 重现性试验：取同一杠板归样品液5份，每份各约3g，按样品溶液制备方法制备样品溶液。精密吸取各样品溶液10μl，进样，测定其峰面积积分值，外标法计算含量，齐墩果酸和熊果酸含量的RSD分别为2.1％(n=5)和1.8%（n=5）。结果表明，样品制备方法重现性良好。

2.6 线性关系试验：用微量注射器精密吸取齐墩果酸和熊果酸对照品混合贮备液中2、6、10、15、25μl进样分析，按色谱条件测定峰面积，以对照品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得齐墩果酸回归方程为：Y=8.02×105X-2.84×104（r=0.9998），熊果酸回归方程为：Y=7.40×105X-5.16×104 （r=0.9998）。表明齐墩果酸进样量在0.228～2.850 μg，熊果酸进样量在0.544～6.800 μg时，线性关系良好。

2.7 加样回收率试验：精密称取已知齐墩果酸和熊果酸含量的杠板归茎样品6份，按高、中、低三种浓度分别加入对照品适量，制备样品溶液，进样测定含量，齐墩果酸平均回收率为97.4%，RSD为1.5%（n=6）；熊果酸平均回收率为96.9%，RSD为1.2%（n=6）。

2.8 样品含量测定：精密吸取制备的样品溶液各20μl进样，平行3次，测定齐墩果酸和熊果酸峰面积积分值，外标法计算齐墩果酸和熊果酸的平均含量。测定结果见表1。

3 讨论

测定结果表明，在杠板归样品不同部位中，杠板归茎中齐墩果酸和熊果酸的含量均最高，远高于叶和地上部位。茎中齐墩果酸含量为叶的4.02倍，熊果酸为叶的4.14倍，且同一部位中熊果酸的含量均明显高于齐墩果酸。提示样品中齐墩果酸和熊果酸主要分布于杠板归茎中。

本试验建立的高效液相色谱法可同时测定杠板归不同部位中熊果酸和齐墩果酸的含量，样品处理简单，提取效率高，待测组分无其它杂质的干扰。加入少量磷酸可以创造弱酸性环境，能有效抑制待测组分齐墩果酸和熊果酸的解离，使拖尾现象得以改善，峰形尖锐对称，分离度符合色谱定量分析的要求。

本实验所用方法简便、快速，分离效果好，数据准确可靠，可为杠板归不同部位中熊果酸和齐墩果酸的定量分析及质量评价控制提供了科学依据。

4 参考文献

［1］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上册.上海:上海科学技术出版社,2000:869-871.

［2］章永红.抗癌中药大全［M］.南京：江苏科学技术出版社,2000:217.

［3］黄鹤飞,张长城,袁丁,等.杠板归抗炎及抑菌活性部位研究［J］.安徽医药,2008,12(7):595-596.

［4］王定永,卢江红.杠板归根化学成分研究［J］.亚热带植物科学,2004,33(2):10-12.

［5］杜瑜,李焕.齐墩果酸的研究进展［J］.中国药房,2006,17(4):304-306.

［6］田代华.实用中药辞典（上卷）［M］.北京:人民卫生出版社,2002,1016-1017.

［7］陈武,熊筱娟,李开泉,等.乌索酸的药理及临床研究［J］.宜春医专学报,2001,13(2):123-125.

［8］王涛,邵敬伟,郭养浩.熊果酸抗肿瘤作用及其机制研究进展［J］.药物生物技术,2008,15(2):148-151.

收稿日期 2010-11-01