枳术汤加味对大鼠肠粘膜屏障功能保护作用的研究

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摘要 目的：探讨中药枳术汤加味对大鼠肠粘膜屏障功能的保护作用。方法：50只大鼠，雌雄不分，随机分为对照组、造模组、治疗组。造模组经腹腔结扎肠系膜上动脉1h，再灌注1h后于1h、24h取回肠粘膜作组织病理学、细胞超微结构和细胞凋亡的观察研究。结果：与对照组比较，造模组缺血再灌注后肠壁粘膜出现不同程度的损伤，治疗组大鼠术前使用中药枳术汤加味，实验中光镜和电镜下观察显示肠粘膜组织结构基本正常，凋亡细胞明显减少。结论：中药枳术汤加味对大鼠肠粘膜屏障有保护作用。

关键词 大鼠　肠粘膜屏障　枳术汤　组织病理　超微病理　细胞凋亡

外科应激状态如大型手术、严重创伤、严重感染、烧伤、休克等，均可造成缺血再灌注损伤。肠道是外科病人应激反应的中心器官之一，应激状态可导致肠粘膜屏障受损，通透性增加，细菌移位，进一步可引起全身炎症反应综合征(sIRS)和全身多器官功能不全综合征(MODS)，因此保护肠粘膜屏障日益受到医学科研及临床工作者临床的重视。本研究通过建立大鼠肠缺血再灌注损伤(I／R)、肠粘膜屏障功能受损模型来观察肠粘膜组织结构、细胞超微结构和细胞凋亡的改变，探讨中药枳术汤加味对肠粘膜屏障的保护作用。现将实验结果总结报道如下。

1　材料与方法

1.1　实验动物分组与实验材料：Wistar大鼠50只(华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，许可证号scxk鄂2004－0007)，雌雄不分，体重250g～300g，随机分为3组，对照组10只；造模组20只，其中缺血再灌注后1h的10只，缺血再灌注后24h的10只；治疗组20只，其中缺血再灌注后1h的10只，缺血再灌注后24h的10只。光学显微镜：OLYM－PUS BX51型；透射电镜：FEI Tecnai G212型；细胞凋亡原位检测(TUNEL)试剂盒：德国宝灵曼公司生产。

1.2　模型制备与检测：5％水合氯醛，腹腔内注射麻醉，按2.5ml／kg给予，无菌条件下，腹部正中切口进腹，在腹膜后右肾上腺上方找出肠系膜上动脉，肝素(100U／100g)静脉注射，3分钟后夹闭肠系膜上动脉，观察2分钟，待肠壁变苍白，血管搏动消失，放回腹腔。1h后恢复血供，此时肠壁变红润，血管出现搏动。关腹再灌注后1h、24h取回肠组织作检查。①组织病理学检查；取回肠组织数小块放入4％甲醛液中固定，常规脱水，石蜡包埋、制成厚度为O，4肛m组织切片，HE染色，在光学显微镜下观察肠粘膜组织病理改变。②电镜检查：另取回肠组织数小块，经戊二醛、锇酸两次固定，脱水后树脂包埋，用超薄切片机切片，再经醋酸铀和柠檬酸铅染色。透射电镜观察肠系膜粘膜组织的细胞超微结构变化。细胞凋亡检查；采用原位凋亡TUNEL法检测回肠粘膜细胞的凋亡。结果判断：每张切片在光镜(10×40倍)下，随机取10个回肠上皮完整绒毛及隐窝，分别计数算每100个肠粘膜细胞中阳性细胞数，其平均值作为每个绒毛隐窝的细胞凋亡百分比。

1.3 中药预处理方法：枳术汤加味组方：枳实10g，白术、山药各30g，制成1g／1ml生药浓度的药液备用，治疗组术前3天给动物中药灌胃，根据参考文献及医用实验动物学中剂量折算系数，确定治疗组剂量。治疗组0.35ml／次，每天2次，术前24h禁食不禁水，对照组术前24h禁食不禁水。

2　结果

2.1　组织病理学观察：光镜下所见：对照组肠壁结构正常。造模组缺血再灌注后1h，肠壁有轻度损伤变化，粘膜绒毛间隙稍增宽，部分粘膜上皮细胞水肿变性，少数上皮坏死脱落；造模组缺血再灌注24h，肠壁结构损伤加重，可见肠壁变薄，肠粘膜受损，绒毛短细，绒毛间距变宽，上皮细胞水肿明显，部分坏死脱落，固有层红细胞增多，炎性细胞渗出，见图1。治疗组缺血再灌注后1h，肠壁结构基本正常；缺血再灌注后24h，肠壁粘膜可见轻微的病理变化，如粘膜绒毛间隙稍增宽，部分粘膜上皮细胞水肿变性，固有层小血管扩张充血、间质水肿等，见图2。

2.2　细胞超微结构的观察：电镜下所见：对照组结构正常，肠粘膜上皮微绒毛及上皮细胞间连接结构完整。造模组缺血再灌注后1h，肠粘膜微绒毛缩短变细，间隙变大，细胞间连接无明显改变；造模组缺血再灌注后24h，肠粘膜上皮细胞微绒毛稀疏脱落，线粒体肿胀空泡样变，内质网肿胀紊乱，上皮细胞间连接，包括紧密连接、中间连接、桥粒及缝隙连接均不同程度损伤，部分桥粒断裂，见图3。治疗组缺血再灌注后1h，肠粘膜上皮细胞超微结构基本正常；缺血再灌注后24h，肠粘膜上皮细胞微绒毛略显稀疏，线粒体、内质网轻度肿胀，细胞间连接无明显改变。

2.3　细胞凋亡的观察：对照组肠粘膜上皮绒毛顶部及隐窝内可见少数个别凋亡细胞。造模组可见凋亡细胞明显增多，其中单个绒毛的TUNEL阳性细胞数最多可达到40～50，见图4。治疗组凋亡细胞明显减少。详见表1。

3　讨论

正常情况下肠道粘膜是防止肠粘膜细菌和肠源性内毒素血症发生的天然屏障。在大型手术、严重创伤、严重感染、烧伤、休克等外科应激原的打击下，肠粘膜功能受到不同程度的损伤，肠道粘膜屏障功能削弱。机体表现出全身非特异性应激反应，除了应激原对机体直接作用外，神经内分泌系统表现出交感一肾上腺髓质系统和下丘脑一垂体一肾上腺皮质激素系统兴奋，引起儿茶酚胺及糖皮质激素大量释放。儿茶酚胺可选择性地出现内脏血管痉挛，以保持心脑等重要脏器的血供，而胃肠血管收缩，血流量减少，肠粘膜缺血缺氧，大量酸性代谢产物堆积，氧自由基及炎症介质大量产生，血管通透性增加，粘膜上皮水肿，细胞膜受损，细胞间紧密连接破坏，细胞坏死和凋亡，绒毛脱落甚至粘膜分层脱落而形成溃疡。肠粘膜屏障的机械屏障、生物屏障、化学屏障、免疫屏障、粘液屏障均遭到破坏，其中最重要的是机械屏障。细菌内毒素移位，可导致肠源性感染。糖皮质激素分泌增加是应激过程中最重要的一个反应，对机体抵抗有害刺激起着重要的作用。但是持续有害刺激，使激素受体数量和亲和力下降，内环境紊乱，陆续可出现应激反应的负效应。

肠粘膜机械屏障，由肠道粘膜上皮细胞、细胞间连接、菌膜组成，应激状态下，其结构的完整性被破坏，致使机械屏障作用减弱。本实验对缺血再灌注损伤(I／R)造模组大鼠肠粘膜的光镜、电镜和细胞凋亡观察显示，再灌注后1h和24h肠粘膜组织结构破坏逐渐加重。治疗组大鼠术前使用中药枳术汤加味，实验中光镜下组织病理、电镜下细胞超微结构的观察显示肠粘膜组织结构趋于正常，细胞凋亡指数的比较显示细胞凋亡减少，表明肠粘膜屏障得到较好的保护。但是，中药枳术汤加味对肠粘膜屏障保护作用的机理，尚有待进一步研究。