超滤技术浓缩分离羊肚菌胞外多糖的研究

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摘要：目的确定超滤技术浓缩纯化羊肚菌胞外多糖的最佳条件。方法以截留率和膜通量为参数，从超滤膜大小、超滤压力、超滤温度3个因素优选最佳超滤条件。结果超滤羊肚菌胞外多糖的最佳条件为：用截留Mr 10×103的超滤膜，超滤压力0.100 MPa，超滤温度20 ℃。结论在此条件下，胞外多糖截留率达到95.72 %。

关键词：超滤；羊肚菌；多糖

中图分类号：S646.2文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)11-0035-03

Study on Separation of Extracellular Polysaccharide from Morchella by Ultrafiltration

LI Wei1, WANG Zhong-min2 , GONG Ping3 , ZHAO You-xi3, JIA Jun-li4

(1. College of Food Science, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China; 2. Xinjiang Uygur Autonomous Region Food and Drug Administration, Urumqi 830000, China; 3. Biochemical Engineering College of Beijing Union University, Beijing 100023, China; 4. Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute for Drug Control, Urumqi 830000, China)

Abstract：Objective To study the optimum condition of concentration and purification of extracellular polysaccharide from Morchella by ultrafiltration technology. Methods With retention rate and membrane flux as parameters, the optimum ultrafiltration condition was defined by investigating the size of ultrafiltration membrane, ultrafiltration pressure and temperature. Results The optimum ultrafiltration condition for extracellular polysaccharide from Morchella was as follows: ultrafiltration membrane with a molecular cut off of 10 ×103, ultrafiltration pressure of 0.100 MPa and temperature of 20 ℃. Conclusion Under this condition, the retention rate of extracellular polysaccharide from morchella can be up to 95.72 %.

Key words：ultrafiltration; Morchella; polysaccharide

羊肚菌属子囊菌亚门（Ascomycotina）盘菌目（Peziaies）马鞍菌科（Helveliiaceae）羊肚菌属（Morchella），因其菌盖表面呈许多小凹坑，外观极似羊肚而得名，是珍贵的野生食药用真菌。本草纲目中对羊肚菌的记述是“甘寒无毒、益肠胃、化痰理气”[1-3] 。现代药理研究表明，羊肚菌多糖是药用有效成分之一，有增强机体免疫力、抗疲劳、抗病毒、抑制肿瘤等诸多功效[4]。羊肚菌富含蛋白质、多糖、核酸以及多种微量元素和维生素。以羊肚菌为原料的保健品已得到美国 FDA的许可。已有大量的研究分析羊肚菌中的多糖、蛋白质、核酸、生物碱、有机酸、甾醇、萜类及无机盐、维生素等活性物质，但对羊肚菌深层发酵提取胞外多糖的研究尚少。我们利用超滤技术研究确定了羊肚菌胞外多糖提取浓缩纯化的最佳条件，为进一步放大实验和工业化生产的优化和控制提供理论依据。

1材料

1.1菌种

黑脉羊肚菌As 50536（中国农业微生物菌种保藏管理中心）。

1.2对照品

葡聚糖（相对分子质量500 000，Sigma公司）。

1.3培养基

斜面种子培养基PDA：马铃薯20.0 %，蔗糖1.5 %，琼脂1.8 %，水1 000 mL；液体发酵培养基PDGH：马铃薯20.0 %，蛋白胨0.1 %，葡萄糖2.0 %，MgSO4・7H2O 0.1 %，KH2PO4 0.1 %。

1.4试剂

乙醇、氢氧化钠、柠檬酸钠、无水硫酸钠、硫酸、苯酚、硫酸铜等均为分析纯。

1.5主要仪器

UV-1700紫外分光光度计（Shimadzu公司）；3K15型离心机（Sigma公司）；QL-901型旋转混匀器（海门其林贝尔仪器制造公司）；THZ-D台式恒温摇床（太仓实验设备厂）；RO(NF)-UF 4010型实验室膜分离装置膜组件：截留相对分子质量分别为10×103，50×103，100×103；有效膜面积分别为0.1，0.1，0.4 m2 （上海东亚核级树脂公司）；0.2 μm微滤组件（天津膜天膜工程技术公司）；HH-4数显恒温水浴锅（金坛宏华仪器厂）。

2方法

2.1羊肚菌培养

培养基常规灭菌。温度25 ℃、接种量10 %、装量50 mL/250 mL 三角瓶，加10 粒玻璃珠pH 7.5，转速180 r/min，摇床培养3 d。测量菌丝体密度，二层纱布过滤菌丝体，得羊肚菌发酵液。

2.2预处理及超滤方法

预处理粗提液除去杂质以减少对膜的污染[5，6]。用0. 45 μm微孔滤膜除去粗提液中的固形物，以避免超滤时固形物堵塞膜。

2.3超滤条件的优化

以截留率和膜通量为参数，超滤膜大小、超滤压力、超滤温度3项因素优选最佳超滤条件。

2.4乙醇沉淀

浓缩液加入3倍体积无水乙醇，－4 ℃冷藏。24 h后 5 000 r/min离心15 min收集沉淀，重复数次，干燥，得粗多糖。

2.5Sevag法脱蛋白质

将粗多糖溶于适量水中制成多糖液，按5∶1的比例加入氯仿正丁醇溶液，置分液漏斗中振荡，分出上层糖液层，重复数次。浓缩多糖液，干燥得白色晶状脱蛋白质多糖。

2.6多糖含量的测定

培养基中夹带的淀粉、蔗糖等糖类物质的干扰会影响羊肚菌胞外多糖含量的测定，所以采用改进的ROBERTS铜方法测定羊肚菌胞外多糖[7-9]。用葡聚糖做标准曲线。

2.7膜通量与截留率计算方法

膜通量 J = V/(A×t)

式中 J：膜通量[mL・（cm2・min）-1]；V：透过液体积（mL）；A：膜的有效面积（cm2）；t：操作时间（min）

截留率=(截留液中多糖体积×截留液中多糖浓度)／(料液中多糖体积×料液中多糖浓度)×100 %。

3结果

3.1羊肚菌胞外多糖相对分子质量的分布

制取的多糖相对分子质量（Mr）分布一般范围较宽，从几千至几万不等。如果不确定所要分离的多糖Mr的大小，则需预选确定截留值[10]。本实验控制超滤压力0.100 MPa，超滤温度20 ℃；将羊肚菌发酵液顺序用100×103，50×103，10×103超滤膜处理，分别测定各级截留液及10×103超滤膜透过液中羊肚菌胞外多糖的Mr，结果100×103以上占23 %，(50～100)×103占25 %，(10～50)×103占44 %，＜10×103占3 %，损耗5 %。

经测定，10×103超滤膜超滤所得截留液中羊肚菌胞外多糖高达92 %。直观分析，100×103，50×103和10×103超滤膜截留液，10×103超滤膜透过液的颜色和浊度呈梯度递减，10×103透过液几乎澄清。因此，用10×103超滤膜可得到大部分羊肚菌活性多糖。因为连续使用3个膜组件超滤，多糖有5 %的损耗。实验还表明，100×103与50×103超滤膜组件的超滤速度快于10×103的膜组件。

3.2超滤膜超滤参数比较

超滤膜截留Mr的选取应遵循下列标准：在基本保证截留率的条件下，使膜通量最大，才能保证超滤的效率。一般情况是，不同截留Mr的膜，其超滤通量随截留Mr的增加而增加，但多糖损失亦增加。100×103超滤膜通量虽大，但多糖截留率不高。因此，本实验控制超滤压力为0.100 MPa，温度为20 ℃，比较10×103和50×103两种规格超滤膜组件的截留率和平均膜通量，结果见表1。

由表1可见，两种膜平均膜通量相差不大，但10×103超滤膜对多糖的截留率远远优于50×103的，几乎没有损失多糖。因此，截留Mr为10×103的超滤膜可作为较理想的超滤膜组件。

3.3超滤压力的选择

选择截留相对分子质量为10×103的RO(NF)-UF 4010型超滤膜组件，控制超滤温度为20 ℃，调整滤膜出口端的限流阀控制超滤压力，将400 mL发酵液浓缩为40 mL。研究截留率、平均膜通量随超滤压力变化的情况，结果见表2。

由表2 可见，平均膜通量随超滤压力的增加而增加，但增幅逐渐减少，并且随压力增加截留率相应降低。实验表明，尽管采用0.120 MPa压力其初始通量较大，但随超滤时间延长，膜通量下降速度较快，逐渐接近0.100 MPa压力下相应时间的膜通量。这是由于溶液中溶质与溶剂通过膜的速率不同，在膜界面溶质浓度大幅上升，出现浓差极化，降低了溶剂的通量[11]，如果持续运行膜将被严重污染。而且，在0.120 MPa压力下设备出现抖动现象，长时间运行会严重损坏。因此，实际操作时选用0.100 MPa较为适宜。

3.4超滤温度的选择

选择截留Mr为10×103的RO(NF)-UF 4010型超滤膜组件，控制超滤压力0.100 MPa，调整恒温水浴槽温度控制超滤温度，将400 mL发酵液浓缩为40 mL。研究不同超滤温度下的截留率及膜通量，结果见表3。

由表3可见，这个组件的膜通量随超滤温度升高先增加后减少，截留率则随温度增加逐渐下降。究其原因，（1）多糖水溶液大多是胶体溶液，黏度大且组分Mr差别悬殊。温度升高提取液黏度下降，扩散系数和传质系数增大，相应会减少“浓差极化[12]”；但在较高温度下超滤膜会膨胀，膜孔径减小，膜通量反而减少。（2）温度升高加速了膜组成聚合物的微观布朗运动，增加了单位时间单位体积形成小孔的几率，从而造成截留率下降。而且温度过高会使多糖变性失活，故生物活性物质不能用升温来提高超滤速度。综合考虑，室温20 ℃为最佳超滤温度。

4讨论

实验证明，深层发酵技术具有易操作、菌丝体增生快、生产周期短、产量大等优点，以深层发酵菌丝体和发酵液为主要原料提取羊肚菌各种营养成分和活性成分，可明显降低成本，提高生产效率[13]。

采用超滤技术从羊肚菌发酵液浓缩制取多糖的报道少见。本方法不仅可以浓缩澄清多糖，还可分离发酵液中残余的培养基组分，包括糖、含氮物质、无机盐等。因此，采用超滤工艺进一步脱除截留液蛋白质后，可直接干燥获得粗多糖。采用合适的超滤膜能够有效的分离提纯大部分羊肚菌胞外多糖。

本研究表明，羊肚菌胞外多糖的最佳超滤条件是：截留Mr 10×103的超滤膜，超滤压力0.100 MPa，超滤温度20 ℃浓缩，截留率可达到95.72 %。但由于设备和时间的影响，本文中的一些条件可进一步优化，这有待于进一步研究。

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