白蛋白纳米基因载体的制备与表征
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【摘要】 目的 研制白蛋白纳米基因载体，评估白蛋白纳米粒用作基因载体的可行性。方法 采用去溶剂化法制备白蛋白纳米粒，并通过控制转速、pH值、搅拌时间三个变量来考察白蛋白纳米粒的表征变化情况，以PicoGreen荧光法来测白蛋白纳米载体的基因转载率，并用流式细胞仪检测膀胱癌细胞的基因转染率。结果 控制转速1000 RPM，自然状态下的溶液pH值(6.9)，持续搅拌12 h条件下，制得满足基因载体需要的白蛋白纳米粒的平均粒径 (253.1±11.9) nm，zeta电位 (-34.0±4.5) mV，PDI 0.43±0.04，性质相对稳定，基因转载率为(97.61±0.06)%，转染率为(48.21±5.94)%。结论 单纯质粒很难进入细胞核高表达，借助白蛋白纳米载体，使高效的基因转染成为可能。白蛋白纳米粒有望被广泛应用为二次基因转载工具。
【关键词】
人血清白蛋白纳米粒；基因载体；纳米粒
基金项目：广东省科技计划资助项目(项目编号：2009B060700099)
作者单位：519000珠海，中山大学附属第五医院泌尿外科(李怀富 徐峰 阮国锋 郑浩 郑小青 韦胜威 詹鸣)，妇科(阮国锋)；中山大学附属第三医院皮肤科(李晓欣)
单纯质粒转染肿瘤细胞时，很容易被细胞内各种酶降解，能够进入细胞核进行表达的质粒很少，而白蛋白纳米载体能很好地保护质粒免受细胞内各种酶的降解［1］，从而有效地介导质粒DNA(plasmid DNA, pDNA)与肿瘤细胞DNA的整合，获得重组质粒在肿瘤细胞核内的稳定、持久表达。近10年国内外的研究也确实证实了白蛋白纳米载体是一种良好的非病毒基因投递系统［2-4］，具有结合浓缩DNA及将DNA高效地靶向导入各种细胞的能力［5-6］。
白蛋白纳米粒最初被广泛应用于制备缓释以及控释药物方面研究［7］，研究表明白蛋白纳米粒具有良好的缓释功能，易被生物降解，无生物毒性，从而推动了白蛋白纳米粒用作基因载体的研究［8］。而作为基因载体的白蛋白纳米粒要求粒径相对较小、携带合适的表面电荷，性质相对稳定，制备过程不能引入对目的基因有损伤的物理、化学及生物因素。本研究将详细阐述如何获取满足实验需求的白蛋白纳米基因载体，并进一步评估白蛋白纳米粒用作基因载体的可行性，为将来接下来白蛋白纳米粒用作基因载体转载超抗原SEA基因靶向灌注治疗膀胱癌的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器 人血清白蛋白A1653(sigma公司)，50%戊二醛(广州齐云生物技术公司)，无水乙醇(南京化学试剂有限公司)，扫描电镜JSM-6360LV (日本电子)，Zetasizer Nano-ZS90(英国马尔文公司)，SHT型精密数显磁力搅拌电热套(菏泽祥龙电子科技有限公司)，电子天平BP 221S (德国sartorius)，超纯水器MILLI-QB (美国MILLIPORE)，ALLEGRATM 64R(BECKMAN)，漩涡混合仪XW-80A(其林贝尔仪器公司)，人膀胱癌细胞株T24(上海细胞生物研究所)，RPMI 1640(GIBCO公司)，10%小牛血清等。
1.2 制备白蛋白纳米粒(human serum albumin nanoparticles, HSA-NPs)的基本过程：①电子天平精确称取30 mg人血清白蛋白，加入纯水配成5 ml溶液，用漩涡混合仪混匀。②室温(25℃)持续搅拌 (1,000RPM)下，滴加(1 ml/min)无水乙醇6.5 ml。③继续搅拌1 h后，滴加3.34 μl［9］ 40%(v/v)戊二醛，室温下持续搅拌过夜(12 h)。④离心(12,500 RPM，55 min，4℃)3次纯化，弃去上清 (pH 6.9)，开盖减压蒸馏，待残存的乙醇挥发后，再加纯水分散沉淀，继续离心(3000 RPM，5 min，4℃)，收集上清即得到白蛋白纳米溶液。⑤ -20℃冰箱保存备用。
1.3 白蛋白纳米粒表征的考察 用纳米力度及Zeta电位分析仪测量白蛋白纳米粒的粒径、zeta电位及PDI。 将白蛋白纳米溶液离心(12,500 RPM，55 min，4℃)后，收集沉淀，用70%乙醇脱水，分别设置高浓度组(50 mg白蛋白纳米粒：50 ml 70%乙醇组)和低浓度组(5 mg白蛋白纳米粒：50 ml 70%乙醇组)，直接滴台，待自然风干后喷金，用扫描电镜观察白蛋白纳米粒的形态及分布特征。
1.4 考察单个变量改变对白蛋白纳米粒表征的影响 制备白蛋白纳米粒过程中，每次仅改变单个变量，其他变量保持不变，考察单个变量改变对白蛋白纳米粒表征的影响。
1.5 考察白蛋白纳米粒的稳定性 将白蛋白纳米溶液在室温下静置保存10 d，对比10 d前后样品的表征、粒径和zeta电位及PDI变化情况。
1.6 基因转载率的测定 白蛋白纳米粒制备起始阶段加入0.1 mg携带超抗原SEA基因的质粒(plasmid SEA, pSEA)，用PicoGreen荧光法［10］测定白蛋白纳米粒的基因转载率，并用公式计算：基因转载率= (使用的SEA基因量-未包封的SEA基因量)／使用的SEA基因量 100%。
1.7 体外膀胱癌细胞培养及转染实验 ①用含10%小牛血清、100 IU/ml青霉素及100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基，在5%CO2、37℃孵箱中培养膀胱癌细胞，每两天传代1次，取对数生长期的膀胱癌细胞接种于24孔板(2×105个/孔)，加入10% 小牛血清、RPMI1640培养液(含青、链霉素)，于5%CO2、37℃孵箱中培养24 h，细胞达到80%～90% 融合率时即可进行转染实验。②转让前1 h，将24孔板内的培养液全部吸除，更换400 μl含10% 小牛血清的RPMI1640培养液(不含抗生素)，加入5 μg新制备的pSEA-HSA-NPs(plasmid containing pSEA encapsulated in HSA-NPs)进行转染试验，并用等量的pSEA、pSEA-LipofectamineTM 2000、空白HSA-NPs、生理盐水加入24孔板作对照。轻轻摇匀，置入CO2培养箱中孵育4 h，去除培养液，以PBS洗涤2次，加10% 小牛血清的RPMI1640培养液继续培养48 h。③将转染48 h的膀胱癌细胞用PBS液清洗，以0.02% EDTA和0.25%胰蛋白酶消化后，1000 rpm离心5 min，并用PBS溶液重悬、流式细胞仪测膀胱癌细胞的基因转染率。
2 结果
2.1 纳米粒度及Zeta电位分析仪分析结果
去溶剂化法制备白蛋白纳米载体过程中，在转速1000 RPM，pH6.9 (未调节溶液pH值)，持续搅拌12 h时，制得的白蛋白纳米粒的平均粒径 (253.1±11.9)nm，Zeta电位(-34.0±4.5)mV，PDI 0.43±0.04，性质相对稳定。
2.2 扫描电镜分析结果 高浓度下，HSA-NPs呈球形，大小较均一，散在分布或部分聚集在一起，分散性比较差；低浓度下，HSA-NPs呈球形，基本呈散在分布，大小较均一，分散性较好。
2.3 单个变量改变对白蛋白纳米粒表征的影响 ①一定范围内，搅拌速度越快，粒径相对越小；pH越接近等电点，粒径相对增大，越不容易形成纳米粒；搅拌时间越长，交联越充分，粒径相对较大，当达到完全交联后，即使再延长搅拌时间，粒径不会再增大。②搅拌一般不会引起电荷变化，盐酸调整pH时解离后电荷相抵消，pH距离等电点越远，所带净电荷数越多。
2.4 白蛋白纳米溶液稳定性考察 白蛋白纳米溶液室温下静置保存10 d后，白蛋白纳米粒的粒径有所增大，电荷也有所衰减，但变化幅度都比较小，PDI无明显变化，性质相对较稳定。
2.5 PicoGreen法测得结果经公式计算基因转载率 (97.61±0.06)%。
2.6 流式细胞仪检测 pSEA-HSA-NPs、pSEA 和 pSEA-LipofectamineTM 2000 组 48 h 转染率分别为(48.21±5.94)%、(0.72±0.26)%和(21.36±3.80)%。
2.7 不同的载体转染效率对比结果(图1)：
3 讨论
人血清白蛋白A1653的等电点为4.7，在pH值为6.9时, 白蛋白表面携带负电荷，同时白蛋白纳米溶液的zeta电位也表明白蛋白纳米粒表面携带负电荷。当向白蛋白纳米溶液中加入pDNA后，白蛋白和pDNA表面均携带负电荷，可能不利于二者结合，但pDNA的带电量很小，去溶剂化过程采取一步法制备携带目的基因的白蛋白纳米粒，pDNA则因戊二醛的醛基与白蛋白的氨基之间强烈的缩合反应(共价键的形成)，同性电荷之间的斥力几乎可以忽略不计， 库仑力(反比于距离的平方)也只有在很接近时才表现出明显的斥力，而白蛋白纳米粒的粒径很小，表面积很大，巨大的表面积可以显著增强白蛋白纳米粒的囊化作用。pDNA同时也可以部分交联或共价结合在白蛋白纳米粒的表面。电荷作用的综合效应使携带目的基因的白蛋白纳米粒携带负电荷，研究表明阴离子纳米粒比阳离子纳米粒更容易扩散，而负电荷能维持基因投递［11］。
此外，白蛋白和戊二醛的比例决定着白蛋白纳米的交联度，我们选择了40%的戊二醛浓度(形成稳定纳米粒的必要条件)［12］，人血清白蛋白与戊二醛的比例为1∶0.1，可获得较高的交联度，高度交联能提升质粒俘获。同时，zeta电位的绝对值愈大者载药量也愈大，我们制备的白蛋白纳米粒溶液的zeta电位绝对值大于30.0 mV，当向白蛋白纳米溶液中继续引入带负电荷的pDNA后，一方面溶液的zeta电位绝对值会继续大，能维持良好的基因携载能力，另一方面向溶液中引入负电荷也会增加白蛋白之间的斥力，减少白蛋白与戊二醛之间的交联，使粒径变小，更有利于目的基因的转染。
我们采取去溶剂化法制备白蛋白纳米基因载体，未引入对质粒DNA有损伤的物理及化学损伤因素，制得的白蛋白纳米基因载体的粒径大小、zeta电位及基因转载率均显示白蛋白纳米载体满足纳米基因载体的要求，能够用作二次基因载体。携带超抗原SEA基因的白蛋白纳米载体基因转染率及转染效率(图1)明显高于LipofectamineTM 2000，表明白蛋白纳米载体满足高效基因转染的要求，将在肿瘤防治方面发挥重要作用。
参 考 文 献
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