苏云金芽胞杆菌cry7Ab9基因的克隆与杀虫活性的测定

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1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株与质粒本文所用菌株和质粒见表1.

1.2.3cry7Ab9基因的原核表达及杀虫蛋白质的提取将鉴定得到的重组质粒pEB-cry7Ab转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，并进行阳性菌株筛选，同时利用IPTG诱导表达，收集诱导物离心弃上清，进行SDS-PAGE电泳进行检测.将获得的阳性菌株，诱导表达.利用10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）悬浮，超声波破碎菌体，收集上清，确定蛋白质浓度.

1.2.4杀虫活性测定

将待测样品稀释成不同梯度，取适量干土豆丝加入待测样品稀释液浸泡再称取100 g试验用土混匀，分装入经消毒的6孔培养板中.然后每空接入暗黑鳃金龟幼虫一头，每个浓度梯度重复5次，放置25 ℃光照培养箱中，分别于7 d及两周调查死、活虫数.以10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）溶液作为对照，试验方法同上.

2结果与分析

2.1Bt QZG121菌株伴孢晶体形态的观察

Bt菌株QZG121在1/2LB培养基上培养48 h后，形成单菌落，菌落乳白色，圆形或近圆形，36 h左右可观察到晶体.挑取单菌落少量，制片，油镜下观察，可见伴胞晶体形态为菱形，见图1.

2.2cry7基因的鉴定与克隆

对本实验室保存的22株野生菌利用K5un7/K3un7进行了cry7基因鉴定，发现一株含有1.3 kb左右片段的菌株QZG121.利用PMD18-T载体，筛选挑取阳性克隆，并对阳性克隆PMD18-T载体进行酶切分析及核苷酸序列测定.测序结果利用NCBI blast比对分析，确定核苷酸序列与cry7Ab最为相似，相似度最高达到96%.酶切鉴定结果见图2.

3讨论

本研究从千山分离得到22株苏云金芽胞杆菌中鉴定得到2株含有cry7基因型的菌株，检出率为909%.应用PCR法鉴定出其中一株Bt菌株QZG121中含有cry7Ab基因，并成功克隆到 1 个新的苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry7ab9.通过构建原核表达载体，获得阳性重组质粒pEB-cry7Ab，转入E.coli BL21（DE3），cry7Ab9基因在E.coli BL21（DE3）中能正常表达.SDS-PAGE分析表明，表达蛋白的相对分子质量为130 000.目前只报道了5种cry7类模式基因，其中cry7Aa 对马铃薯甲虫有杀虫活性，cry7Ba1对小菜蛾有杀虫活性，cry7Ca1对蝗虫有杀虫活性.它对鳞翅目、鞘翅目和直翅目害虫均具有较高杀虫活性，故cry7类基因存在巨大的挖掘潜力，在生物防治方面有着广阔的前景.本研究发现的cry7Ab9基因与已知的cry7Ab6基因相似性高达9825%.目前已知的8种cry7Ab类基因，只有邓淑等报道cry7Ab4表达蛋白质对鞘翅目害虫有杀虫活性 [8].本研究发现的cry7Ab9基因表达蛋白对暗黑鳃金龟幼虫进行初步生测，表现出一定杀虫活性.cry7Ab9新基因的发现不仅丰富了cry7类基因的种类，而且可以为鳞翅目、鞘翅目和双翅目害虫的防治以及抗性治理提供新的途径，也为研究蛋白质结构和功能的关系提供实验材料，特别是对鞘翅目类害虫的生物防治提供了新的基因资源.cry7Ab9基因与已知的cry7Ab6基因的相似性极高，但cry7Ab6基因并未表现出对鞘翅目的杀虫活性，这种相似性极高的同类基因所表现的活性差异，可以从生物信息学角度探索Bt杀虫晶体蛋白杀虫谱窄的解决方法，以期拓宽杀虫谱，提高Bt杀虫晶体蛋白在生物防治方面的利用价值.

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