一步法RT—PCR 检测东北油豆角上3种病毒

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摘要：对普通菜豆中常见的3种病毒在哈尔滨市栽培的油豆角上的发生情况进行了调查，为解决油豆角病害问题，发展油豆角生产，提供有益的探索。

关键词：油豆角；RT-PCR；BCMV；CMV；BYMV

中图分类号：S436.43 文献标识码：A

1 引言

油豆角是我国东北地区特有的一种菜豆品种，品质好，嫩荚，外观亮丽，营养丰富，纤维少，口感好，深受市民欢迎。油豆角目前已成为黑龙江省最具地方特色的优质农产品之一，是黑龙江省农产品的一张“名片”。随着东北饮食文化在全国的推广，油豆角正逐渐被全国消费者所接受，市场需求旺盛。黑龙江省油豆角播种面积每年约2.46万hm2，产量约51.5万t。目前油豆角的生产正在全国范围内进行合理区域布局并向保护地延伸发展，在全国形成了海南、广东、广西等地的反季节生产基地，山东、河北等地的保护地越冬及早春栽培基地，东北保护地生产基地及东北露地生产基地[1]。

然而，近年来病害特别是病毒病害的发生导致油豆角产量降低，品质变差，严重制约了油豆角生产。病毒病在幼苗、成株期均可发病，其症状常因品种、毒源种类、环境条件或植株发育阶段不同而异，田间症状颇为复杂，有明脉、斑驳、皱缩、扭曲畸形、变小等多种；有的病株矮缩，开花迟缓，花少，结荚少，结出的豆荚品质差，有的可能出现斑点或斑驳。

引起菜豆病毒病的病毒多达数十种，在我国至少也有10余种，常见的有3种，即菜豆普通花叶病毒（BCMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、菜豆黄花叶病毒（BYMV）。本研究对哈尔滨市辖8区10县（市）油豆角主要栽培区域进行取样检测，调查普通菜豆中3种常见病毒在油豆角上的发生情况。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 供试材料

从哈尔滨各区县露地栽培的油豆角上采集带有疑似病毒病症状的叶片，自封袋装好，带到实验室，立即放到-86℃超低温冰箱中冻存备用。

2.1.2 主要试剂

本研究用到的主要试剂有液氮、植物总RNA提取试剂盒和一步法rt-pcr试剂盒，两个试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品。

2.1.3 引物设计

本研究所用引物均参考于前人的研究论文，3种病毒检测所用引物见表1。

叶片总RNA的提取采用天根公司生产的植物总RNA提取试剂盒。

（1）首先称取50 mg叶片样品，放入预冷的研钵中，加液氮充分研磨成粉末，迅速转入预冷的1.5 mL离心管， 加入450μL RL（裂解液，使用前已加入1%β-巯基乙醇），涡旋剧烈振荡混匀，在56℃恒温水箱中孵育3min。

（2）将所有溶液转移至过滤柱CS上（过滤柱CS放在收集管中），12000r/min离心5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

（3）缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇（通常为225μL），混匀（此时可能会出现沉淀），将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

（4）向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

（5）DNaseⅠ工作液的配制：取10μL DNaseⅠ储存液放入新的RNase-free的离心管中，加入70μLRDD溶液，轻柔混匀。

（6）向吸附柱CR3中加入80μL 的DNaseⅠ工作液，室温放置15min。

（7）向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

（8）向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW1，室温静止2 min ，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

（9）重复步骤（8）。

（10）12000r/min离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

（11）将吸附柱CR3放入一个新的RNase-free的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30～100μL RNase-free ddH2O，室温放置2min，12000r/min离心2min，得到RNA溶液。

2.2.2 一步法RT-PCR

RT-PCR反应采用天根公司生产的一步法RT-PCR试剂盒。

（1）完全融化模板RNA、特异性引物、超纯dNTPmix，10×RT-PCR Buffer，RNase-free ddH2O和5×RT-PCR enhancer，短暂离心后置于冰浴上。

（2）在冰浴条件下按如下比例配制反应液：10×RT-PCR Buffer 5μL，超纯dNTPmix（10Mm each）2μL，5×RT-PCR enhancer 10μL，RNasin（40U/μL）0.5μL，Hotmaster Taq polymerase（2.5U/μL） 2.5μL，Quant RTase（for one step）0.5μL，上游特异性引物（10μM）3μL，下游特异性引物（10μM） 3μL，总RNA模板200ng，补RNase-free ddH2O至总体系50μL。

（3）启动PCR仪直到温度上升至50℃时，将反应管放入PCR仪中。RT-PCR反应按如下步骤进行：反转录反应50℃30min，PCR初始变性94℃2min，变性94℃30s，退火温度按表1列举的进行，退火时间30s，延伸72℃1min，PCR反应进行35个循环，最终延伸72℃10min。

（4）琼脂糖凝胶电泳检测：取上述扩增产物5μL，加入1μL 6×DNA 上样缓冲液，在含有0.005%溴化乙锭（EB）的2%琼脂糖凝胶中电泳0.5～1h，电压150V，当溴酚蓝前沿迁移到胶的2/3处时，停止电泳，取下胶块，放入凝胶成像系统中观察，保存图像，记录结果。

3 结果分析

在抽取的126个样品中，带有菜豆普通花叶病毒的83个，带毒率65.87%；带有黄瓜花叶病毒（CMV）的105个，带毒率83.33%；带有菜豆黄花叶病毒（BYMV）的0个，带毒率0%；BCMV和CMV复合侵染的92个，复合侵染率73.02%。图1和图2是部分样品琼脂糖凝胶电泳图片。

4 结论与讨论

通过这次调查发现哈尔滨市辖8区10县（市）露地油豆角病毒病发生比较普遍，其中油豆角最常感染的病毒是黄瓜花叶病毒，其次是菜豆普通花叶病毒，而且有两种病毒复合侵染的情况发生，尚未发现有菜豆黄花叶病毒的存在。

近年来，露地油豆角病毒病的发生越来越普遍，也愈发严重。其实，除了这3种菜豆上常见的病毒，能够侵染菜豆的病毒还有菜豆矮缩病毒（BDDV）、菜豆和性黄花叶病毒（BMYMV）、花生矮缩花叶病毒（PSV）、蚕豆萎蔫病毒（BBWV）、苜蓿花叶病毒（AMV）、三叶草黄脉病毒（CYVV）等，本次调查未涉及，所以要想最终了解有多少种病毒侵染油豆角，还需进一步开展工作。

油豆角病毒病目前没有特效药可以治疗，亟需加强抗病育种工作，找到抗原材料应用到新品种选育中，培育出抗病品种是解决病害问题的最有效途径。

参考文献：

[1] 冯国军.黑龙江优质菜豆种质资源研究及育种策略[D].哈尔滨：黑龙江林业大学，2008：3.

[2] 王 杰，王晓鸣. 菜豆种子中菜豆普通花叶病毒的RT-PCR检测[J]. 植物保护学报， 2006， 33 （4） ： 345～350.

[3] 王丽花，瞿素萍，杨秀梅. 百合上黄瓜花叶病毒的一步RT-PCR 检测[J].天津农学院学报，2007， 14 （4） ： 9～12.

[4] 王 信，王晓鸣.菜豆黄花叶病毒外壳蛋白（CP）序列分析[J].现代农业科技，2011（10）：44～48.