α-地中海贫血实验室诊断技术进展

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【摘要】地中海贫血(thalassaemias),是由于某类珠蛋白合成受抑制所引起的溶血性贫血,但并不涉及血红蛋白结构的异常。是人类最常见的单基因遗传病。总结近年α-地中海贫血实验室诊断技术,为提高地中海贫血诊断的准确性,减少误诊和漏诊,需要要已有的实验技术综合应用,开陈出新,尽力创造最为适合患者诊断的实验手段。

【关键词】α-地中海贫血;实验室诊断;筛查法;基因诊断

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)10-030-2

地中海贫血(thalassaemias),是由于某类珠蛋白合成受抑制所引起的溶血性贫血,但并不涉及血红蛋白结构的异常。是人类最常见的单基因遗传病。地中海贫血共有α、β、γ、δ等几种亚类。其中α-地中海贫血最为常见。α-地中海贫血是由于α-珠蛋白基因缺失或缺陷使α-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制而引起的遗传性溶血性贫血[1]。α-地中海贫血临床表现与α-珠蛋白链的合成减少的程度相关,轻症者可无临床症状或仅有轻微的血液学改变,中间型者为HbH病,有轻至中度贫血,肝脾肿大,黄疸等,重症者为血红蛋白Bart’s胎儿水肿综合征,胎儿常于妊娠晚期(30-40周)死亡或早产后数小时死亡。α-地中海贫血主要见于东南亚和地中海地区,美国黑人,印度次大陆亦相当常见。在我国则以南方地区多见,如广西、广东、四川、云南等地。因α-地中海贫血的高发病率及重症者新生儿死亡,故适当的针对α-地中海贫血的诊断具有重大的现实意义,本文就α-地中海贫血的实验室诊断技术综述如下:

目前实验室诊断技术主要有筛查法和基因诊断法两种[2]:

1筛查法筛查法师实验室诊断α-地中海贫血的基本方法,具有实验方法简便,造价低廉等特点。常见的筛查法包括:血常规测定和血红蛋白分析。

1.1血常规测定:血液常规检测(blood routine test)又称血液一般检测,包括红细胞,白细胞及血小板参数检测。是地中海贫血检测的第一步,地中海贫血的重要特征之一是小红细胞和低色素,因此重要的血液学指标是红细胞平均体积(MCV)及红细胞平均血红蛋白(MCH)。现今临床诊断中应用的地贫诊断MCV截断值为国际地贫协会推荐使用的地贫筛查诊断截断值,为MCV

1.2红细胞形态学检查。在良好的染色血涂片上,正常红细胞的大小形态较为一致,染色淡红色,中央着色较边缘浅。地中海贫血可在血涂片上见红细胞大小不均,异常红细胞,靶形、球形、椭圆形红细胞,多嗜色性红细胞等。可根据红细胞形态初步判断地中海贫血。如HbH病的靶形红细胞较多,红细胞碎片少见。

1.3红细胞渗透脆性试验。即测定红细胞处于不同浓度的低渗盐水溶液中,从开始溶血到完全溶血的界限,主要取决于红细胞表面积与其体积比。因地中海贫血的红细胞膜存在形态异常,故地中海贫血患者红细胞脆性降低[4]。一些医院使用红细胞脆性一管定量法进行α-地贫的筛查[5,6]。把平均红细胞体积(MCV)测定法与红细胞脆性一管法结合,对轻型地贫具有较好的筛查作用[4,7]。

1.4不稳定血红蛋白测定:(1)异丙醇沉淀试验,含不稳定血红蛋白的血标本在加入异丙醇后很快浑浊,并形成绒毛状沉淀。血红蛋白H可出现阳性特征。(2)热变性试验,根据不稳定血红蛋白比正常血红蛋白更容易遇热变性的特性,在50℃时对不稳定血红蛋白进行筛查。α-地中海贫血时沉淀量偏高。本法敏感性不高,但特异性较异丙醇试验高。(3)红细胞包涵体试验,不稳定血红蛋白易变性沉淀形成包涵体。变性珠蛋白包涵体对诊断α-地中海贫血HbH病是一项简易、方便且特异性较高的方法,当HBH含量较少使血红蛋白电泳未见HbH区带时,而可检测包涵体为阳性。同时对α-地中海贫血1与α-地中海贫血2的诊断也有重要意义。

1.5血红蛋白分析:诊断地中海贫血中的各种血红蛋白,并对其进行定性、定量分析。(1)血红蛋白电泳,因各种血红蛋白均带电荷,其等点电均在7以下,故在PH8.5的缓冲液中各种血红蛋白均带负电荷,在电场的作用下都向阳极运动,不同的血红蛋白,其等电点不同,电泳速度不一,故可用电泳分离定性。应用醋酸纤维薄膜作为电泳固相支持物,还可对电泳分离出的不同血红蛋白进行定量分析。(2)毛细管电泳(CE),CE是一类以高压直流电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据式样中各组分之间的淌度和分配行为的差异而实现分离、分析的新型液相分离技术。有分析速度快,灵敏度高,分辨率高,重现性好,样本用量和试剂消耗少,自动化程度高等特点。但因CE仪器只能做单个样本分析,其平均速度不能同醋酸纤维薄膜电泳相比。(3)高效液相色谱(HPLC),现已用于定量分析血红蛋白A2及抗碱血红蛋白。(4)珠蛋白肽链聚丙烯酰胺凝胶电泳,用尿素将血红蛋白解离成多肽链,通过聚丙烯酰胺电泳的电荷效应与分子筛效应,将各种肽链分离,形成不同的区带,当各种珠蛋白链的合成量或结构发生异常时,其珠蛋白链区带相互间的含量比例或电泳迁移率可出现与正常不同的改变,通过各区带间含量比例的测定,可了解各珠蛋白基因表达的信息,可检测出大部分的α-地中海贫血患者。

2基因诊断法随着分子生物学的发展,越来越多的证据表明,遗传病的发生不仅与DNA结构有关,而且与转录水平或翻译水平的变化相关。基因诊断的探测目的物至少包括DNA和mRNA。因为α-地中海贫血是由于α-珠蛋白基因缺失或缺陷使α-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制而引起的遗传性溶血性贫血,大部分α-地中海贫血是由于α-基因缺失所致。故可运用基因诊断法对α-基因进行检查。1983年Mullis建立PCR技术,多年来,这种技术在实际运用中发挥了重要的作用,为遗传病的诊断提供了更加可靠的依据[8-9]。

我国对地贫的基因诊断始于20世纪80年代初,先后经历了DNA点杂交、限制性内切酶酶谱分析、限制性片段长度多态性(RFL P)连锁分析、寡核苷酸(A SO)探针杂交和PCR体外基因扩增等5个发展阶段,特别是PCR及其相关发展技术,已成为最普遍的基因诊断方法。

2.1聚合酶链反应(PCR):PCR是利用DNA聚合酶等在体外条件下,催化一对引物间的特异DN段合成的基因体外扩增技术。应用血红蛋白电泳检测对血红蛋白H病能进行较好的诊断,但对标准型和静止型的α-地贫不能进行有效诊断。以PCR为基础的诊断方法已应用于α-地贫的基因诊断[10,11],并经历了单重[12]、双重[13]至多重[14]几个阶段。

多重PCR它的特点是在一个PCR体系中包含4对等位基因特异引物。根据每个突变位点的特异扩增带来判断结果。在诊断各种缺失型α-地中海贫血时,相对于传统的Southern

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杂交技术,操作简单,周期短,不使用放射性核素,便于临床推广[15]。

多重PCR已广泛应用于实验室诊断,单管可同时对东南亚、左缺和右缺进行检测,特别是对静止型的α-地贫可进行有效检测。

2.2Southern印记杂交法:鉴别DNA靶分子的杂交称为Southern印记杂交,是指DNA与DNA的杂交,将电泳分离的待测DN段转印并结合到一定的固相支持物上,然后用标记的DNA探针检测待测DNA的一种方法。

2.3寡核苷酸(ASO)探针检测法:ASO探针灵敏度高,可以分析样品间的单个碱基变化,最早被用来做遗传性疾病特定突变的检测。本方法将待检DNA样品点在硝酸纤维素膜上,然后与特定的ASO探针杂交,以检测点突变或缺失引起的遗传性疾病。此技术的缺点是必须严格控制杂交条件,否则会出现假阳性或假阴性,另一缺点是成本高[17]。

2.4RFLP连锁分析法:因突变导致限制性内切酶酶切位点消失或形成,从而导致相应的DNA酶切片段的改变,这在群体中表现为限制性片段长度多态性(RFLP)。当探针跨越酶切位点时[16],可在突变点两侧设计引物,使PCR产物含有该突变序列,也可以通过改变引物序列使扩增产物中产生(或消失)酶切位点。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并电泳分离,从而检测地贫基因。

2.5基因芯片:根据基因芯片上不同位置所出现的荧光位点颜色及强弱的变化来判断地中海贫血的基因突变类型,与传统方法比较,基因芯片诊断技术在核酸扩增的基础上,采用荧光标记及引物延伸的方法,可提高检测结果的敏感性和特异性,由于基因芯片高通量特点,可将α、β地中海贫血基因诊断在一张芯片上完成,适用于大面积普查[18]。缺点是芯片造价成本较为高昂,还未能广泛使用于临床检验。

近年随着分子生物学和蛋白组学实验技术迅猛发展,α-地中海贫血的实验室诊断技术亦随之提高。大量的新技术,新方法被应用于α-地中海贫血的实验室诊断中。为做好实验室诊断,在筛查携带者、遗传咨询、产前诊断、选择性流产等方面起到了重要作用。及早的防治地贫,直接关系到人民的健康。为使α-地中海贫血的诊断更方便、更快捷、更便宜,为提高地中海贫血诊断的准确性,减少误诊和漏诊,需要要已有的实验技术综合应用,开陈出新,尽力创造最为适合患者诊断的实验手段。

参考文献

[1] HiggsDR,VickersMA,Wilkie AO,et al.A review of the molecular genetics ofthe human alpha-globin gene cluster.Blood[J].1989,73:108121104.

[2] Li Y,Di Naro E,Vitucci A,et al.Detection of paternally inherited fetal point mutations for β-thalassemia using size2f ractionated cell-f ree DNA in maternal plasma[J].Am Med Assoc,2005,93:843.

[3] Old J,Traeger SJ,Galanello B,et al.Prevention of Thalassaemias and ot her Haemoglobin Disorders[M].(Volume2),Nicosia,Cyprus:Thalassaemia International Federation,2005:1-39.

[4] 何雅军,杨小华,马福广,等.红细胞平均体积和脆性及血红蛋白电泳联合检测在地中海贫血诊断中的价值[J].中华检验医学杂志,2005,28(3):244.

[5] 曾溢滔.血红蛋白的诊断与治疗[J].中华血液学杂志,1996(17):393-395.

[6] 邓捷,刘新质,曾瑞萍,等.应用平均红细胞体积测定法及红细胞脆性一管定量法筛查地中海贫血[J].中华妇产科杂志,2000(10):610-612.

[7] 区丽群,蔡早育,崔金环,等.MCV、MCH、RDW及红细胞脆性试验联合应用在地中海贫血诊断中的作用[J].中国优生与遗传杂志,2002,10(4):120-121.

[8] Saiki RK,Walsh PS,Levenson CH,et al.Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes[J].Proc Natl Acad Sci USA,1989,86(16):6230.

[9] Mullis K.PCR and scientific invention:the t rial of DuPont vs.Cetus[J].The Polymerase Chain Reaction,1994:427.

[10] 李洪义,段山,郑辉,等.四引物等位特异性聚合酶链反应检测α-珠蛋白基因终止密码子突变[J].中华检验医学杂志,2003(26):172-174.

[11] 刘敬忠,周桔,王立荣,等.两种常见缺失型α-地中海贫血快速检测技术的研究[J].中华检验医学杂志,2001(24):333-335.

[12] 肖维威,徐湘民,刘忠英.东南亚缺失型α-地中海贫血的聚合酶链反应快速诊断技术及产前诊断[J].中华血液学杂志,2000(4):192-194.

[13] Baysal E,Huisman TH.Detection of common deletional alpha-thalassemia-2 determinants by PCR.Am J Hematol[J].1994(46):208-213.

[14] Chong SS,Boehm CD,Higgs DR,et al.Single-tube multip lex-PCR screen for common deletional determinants of a-thalassemia.Blood[J].2000,95:360-362.

[15] Baig SM.Molecular diagnosis of beta-thalassemia by mul-tiplex ARMS-PCR:a cost effective method for developing count ries like Pakistan [J].Prenat Diagn,2007,27(6):580.

[16] Zeren F.Preliminary Data on Preimplantation Genetic Diagnosis for Hemoglobinopathies in Turkey[J].Hemoglobin,2007,31(2):273.

[17] Li W,Gao F,Tang W,et al.Detection of known thalassemia point mutations by snapback singlest rand conformation polymorphism:The feasibility analysis[J].Clin Biochem,2006,39(8):833.

[18] Bang-Ce Y,Hongqiong L,Zhuanfong Z,et al.Simultaneous detection of alpha-thalassemia and beta-thalassemiaby oligonucleotide microarray[J].Haematologica,2004,89(8):101.