新洁尔灭消毒液消毒效果验证

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摘要：目的：评估新洁尔灭消毒液的消毒效果。方法：通过中和剂中和效果试验和消毒剂定量悬浮试验来验证。结果：三次独立的平行试验均能够在10分钟内使所有试验菌的数量至少下降99.99%（至少下降4个对数单位）。结论：新洁尔灭消毒液的消毒效果符合使用要求，能够用于洁净区域日常的清洁消毒。

关键词：消毒效果 中和剂 定量悬浮

新洁尔灭（苯扎溴铵）：是一种阳离子表面活性剂类广谱杀菌剂。用于皮肤、黏膜和小面积伤口的消毒。新洁尔灭为复方制剂，主要成分为苯扎溴铵，辅料为纯化水。本品为无色至淡黄色的澄明液体，最低浓度为0.1%。

1、材料

1.1 培养基及试剂

营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、组氨酸、吐温80、卵磷脂、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、新洁尔灭消毒液

1.2 试验菌

金黄色葡萄球菌【CMCC（B） 26003】、枯草芽孢杆菌【CMCC（B） 63501】、大肠埃希菌【CMCC（B）44102】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】

2、方法

2.1 培养基配制方法

营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养、改良马丁琼脂培养基按中国药典附录培养基及其制备方法项下配制。

2.2 中和剂和稀释液：

2.2.1 稀释液

0.03mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.2～7.4，下称PBS）

PBS配制方法：将磷酸氢二钠2.84g与磷酸二氢钾1.36g溶解于1000ml纯化水中，分装，121℃、15min压力蒸汽灭菌后备用

0.9%氯化钠溶液：称取0.9g氯化钠，溶解于1000 ml纯化水中，分装，121℃、15min压力蒸汽灭菌后备用。

2.2.2 中和剂

在每升PBS缓冲液中加入10g组氨酸、50ml吐温-80、5g卵磷脂，分装，121℃、15min压力蒸汽灭菌后备用。

2.3 菌液制备：（菌种要求不得超过5代，采用适宜的方法保存）

取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的斜面培养物，加入10ml0.9%无菌氯化钠溶液，将菌种洗脱。然后吸出菌液（用管口带有薄的棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，制成均匀菌液（菌液浓度不得低于106cfu/ml）。

取白色念珠菌新鲜培养物少许至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养2天，加入10ml0.9%无菌氯化钠溶液，将菌种洗脱。然后吸出菌液（用管口带有薄的棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，制成均匀的菌液（菌液浓度不得低于106cfu/ml）。

2.4 方法：

2.4.1 中和剂中和效果试验：

2.4.1.1 菌液组：

用PBS对制备的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌菌悬液进行1ml9ml的10倍系列稀释并用平皿计数法进行活菌计数，制成每毫升小于100cfu的菌液。取此金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌菌液1ml分别加入无菌培养皿中，注入约15～20ml温度不超过45℃的融化营养琼脂培养基，混匀，30～35℃培养48小时后计数，每种菌液平行做2个平板。

用PBS对制备的白色念珠菌悬液进行1ml9ml的10倍系列稀释并用平皿计数法进行活菌计数，制成每毫升小于100cfu的菌液。取此白色念珠菌菌液1ml分别加入无菌培养皿中，注入约15～20ml温度不超过45℃的融化玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，23～28℃培养3天后计数，每种菌悬液平行做2个平板。

2.4.1.2 试验组（以金黄色葡萄球菌为例）

将消毒剂1.0ml与中和剂9.0ml混合，制成中和产物（中和剂与消毒剂作用后的产物）溶液，再按以下步骤分组进行。

第一组：取消毒剂4.5ml于试管中，加入0.5ml制备好的金黄色葡萄球菌菌悬液，混匀，作用10分钟，吸取此混合液0.5ml于装有4.5mlPBS的试管中，混匀，作用10分钟后，吸取此混合液1ml加入无菌培养皿中，注入约15～20ml温度不超过45℃的溶化营养琼脂培养基，混匀，30～35℃培养48小时后计数，平行做2个平板。

第二组：吸取消毒剂4.5ml于试管中，加入0.5ml制备好的金黄色葡萄球菌菌悬液，混匀，作用10分钟后，吸取此混合液0.5ml于装有4.5ml中和剂的试管中，混匀，作用10分钟后，吸取此混合液1ml加入无菌培养皿中，注入约15～20ml温度不超过45℃的溶化营养化物琼脂培养基，混匀，30～35℃培养48小时后计数，平行做2个平板。

第三组：吸取中和产物4.5ml于试管中，加入0.5ml制备好的金黄色葡萄球菌菌悬液，混匀，作用10分钟，吸取此混合液0.5ml于装有4.5mlPBS的试管中，混匀，作用10分钟，用PBS 做10倍系列稀释，选择适宜稀释度菌悬液，各吸取1ml加入无菌培养皿中，注入约15～20ml温度不超过45℃的溶化营养琼脂培养基，混匀，30～35℃培养48小时后计数，平行做2个平板。

第四组：吸取PBS4.5ml于试管中，加入0.5ml制备好的金黄色葡萄球菌菌悬液，混匀，作用10分钟，吸取此混合液0.5ml于装有4.5mlPBS的试管中，混匀，作用10分钟，用PBS 做10倍系列稀释，选择适宜稀释度菌悬液，各吸取1ml加入无菌培养皿中，注入约15～20ml温度不超过45℃的溶化营养琼脂培养基，混匀，30～35℃培养48小时后计数，平行做2个平板。

第五组：吸取中和剂4.5ml于试管中，加入0.5ml制备好的金黄色葡萄球菌菌悬液，混匀，作用10分钟，吸取此混合液0.5ml于装有4.5mlPBS的试管中，混匀，作用10分钟，用PBS 做10倍系列稀释，选择适宜稀释度菌悬液，各吸取1ml加入无菌培养皿中，注入约15～20ml温度不超过45℃的溶化营养琼脂培养基，混匀，30～35℃培养48小时后计数，平行做2个平板。

第六组：阴性对照组。分别吸取PBS于中和剂1ml加入无菌培养皿中，注入约15～20ml温度不超过45℃的溶化营养琼脂培养基，混匀，30～35℃培养48小时后计数，平行做2个平板，应无菌生长。

2.4.1.3 重复上述操作，直至完成3次试验。

2.4.1.4 按照上述方法进行枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的操作，但白色念珠菌操作时，应使用玫瑰红钠琼脂培养基，并且在23～28℃培养3天计数。

误差率（%）=【（三组均数-第三组回收菌落数+三组均数-第四组回收菌落数+三组均数-第五组回收菌落数）÷3】/三组均数*100%

三组均数=（第三组回收菌落数+第四组回收菌落数+第五组回收菌落数）/3

2.4.1.5 结果判断：

第三、四、五组菌数相似，其误差率≤10%，第六组无菌生长，第一组不长菌或明显少于第二组，第二组菌数明显少于第三、四、五组。符合这些标准，表明中和剂可消除消毒剂对每个试验菌的作用，中和剂及其与消毒剂的中和产物对每个试验菌无毒害，判定所选择的中和剂为该消毒剂的中和剂。

2.4.2 消毒液定量悬浮试验：

2.4.2.1 试验组：（1）取1支无菌带塞试管加入4.5ml待验证消毒液。

（2）取0.5ml金黄色葡萄球菌菌液，接种于上述盛有消毒液的无菌带塞试管中，轻轻摇动，混合均匀，并立即开始计时。（3）10分钟后，取上述混合液0.5ml与4.5ml中和剂中，混匀作用10分钟后，吸取原液或其稀释液1ml加入无菌培养皿中，细菌注入约15～20ml温度不超过45℃的营养琼脂培养基，混匀，平行做2个平板，30～35℃培养24小时后计数。

2.4.2.2 对照组：以稀释剂（PBS）代替待测消毒液，同时同以上步骤操作。

2.4.2.3 重复上述操作，连续做3次实验。

2.4.2.4 按照前面的方法进行枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的操作，但白色念珠菌操作时，应使用玫瑰红钠琼脂培养基，并在23～28℃培养3天计数。

3、结果

4、讨论

4.1 由结果可以看出通过中和剂中和效果试验可以确定，每升PBS缓冲液中加入10g组氨酸、50ml吐温-80、5g卵磷脂可以中和新洁尔灭消毒液的消毒效果，因此，在日常消毒中应该避免以上物质的混入。

4.2 由消毒剂定量悬浮试验结果可以得出新洁尔灭消毒液能够在10分钟内使所有试验菌的数量至少下降99.99%，说明该消毒剂的消毒效果能达到要求，能够用于使用环境日常的清洁消毒。

参考文献：

⑴国家药典委员会， 中华人民共和国药典（二部）[M]，中国医药科技出版社，2010年版。

⑵苏德模，马绪荣，药品微生物学检验技术[M]，华龄出版社，2007年1月第1版。

⑶潘友文，现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术[M]，中国协和医药大学出版社，2004年4月第一版。