川芎嗪洗脱支架对猪冠状动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

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［摘要］ 目的 观察川芎嗪洗脱支架(TES)对平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。方法 在6只小型猪冠状动脉分别植入TES与金属裸支架(BMS)，术后第28天处死动物，用组织病理学方法检测内膜增殖情况，用免疫组化和TUNEL 法观察TES对平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。结果 TES组较BMS组冠状动脉管腔面积增加、支架内新生内膜面积和面积再狭窄百分比减小(P

［关键词］ 川芎嗪；药物洗脱支架；再狭窄

［中图分类号］ R815［文献标识码］ A［文章编号］ 1671-7562(2008)04-0236-04

Proliferation and apoptosis of smooth muscle cells after implantation

of tetramethylpyrazine-eluting stents in the porcine coronary artery

LI Xuan， MA Gen-shan， CHEN Zhong，SU Ya-min，

(School of Clinical Medicine,Southeast University， Nangjing 210009 China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the proliferation and apoptosis of smooth muscle cells(SMCs)after implantation of tetramethylpyrazine-eluting stents(TES). Methods TES and bare-metal stents(BMS)were implanted in coronary arteries of 6 pigs. At the end point time of 28 days， animals were sacrificed and neointimal thickness, antiproliferating cell nuclear antigen(PCNA)of vascular smooth muscle cell(VSMC), apoptosis of VSMC were measured. Results Compared with BMS， luminal area was significantly increased in the TES group(P

Key words: tetramethylpyrazine;drug-eluting stent; restenosis

(Morden Medical Journal,2008,37:236-239)

经皮冠状动脉介入(PCI)治疗是冠心病治疗的一个重要手段，但术后再狭窄一直是影响PCI疗效的主要问题。单纯球囊扩张术由于早期血管弹性回缩及晚期内膜过度增殖、血管再重塑使得术后再狭窄率高达30％～50％。冠状动脉内支架植入术能有效限制血管弹性回缩和动脉再塑型，使PCI术后的再狭窄率明显下降。但由于支架植入术后依然存在内膜增殖，再狭窄发生率仍达20％～30％。药物洗脱支架(DES)通过抑制炎症反应和细胞增殖、延缓血管内皮化，使PCI术后的再狭窄率降至10％以内。但近期公布的随机试验结果认为，DES有增加远期非心性死亡、晚期血栓所致的心源性死亡和(或)心肌梗死的风险［1］。发掘新的抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和血管内膜增生而不影响血管内皮愈合的洗脱药物是研制新型DES和防治支架内再狭窄的新策略。本实验通过对猪冠状动脉植入支架，形成冠状动脉狭窄模型，观察川芎嗪洗脱支架(TES)抑制内膜增生防治再狭窄的疗效并探讨可能的机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组和预处理

选用4~6月龄，质量为25~35 kg的小型猪6只，随机分为TES组和BES组，手术前1 d给予阿司匹林300 mg、氯吡格雷300 mg顿服。

1.2 支架和涂层

TES组的TES是由金属裸支架(BMS)经喷涂川芎嗪单体(四甲基砒嗪纯度为99%,购于上海华美制药厂)制成，为双涂层，其内层为甲基丙烯酸甲酯共聚物及川芎嗪颗粒，质量比为50∶50，涂层厚度为210～310 μm，含川芎嗪200 μg，外层为聚乙醇酸(PGA)。BMS组采用相同结构金属裸支架。两组支架均为不锈钢316 L金属管形网状支架，支架大小均为(2.5～3.0)/16 mm。

1.3 冠脉内支架植入

猪术前予氯胺酮12 mg•kg-1肌肉注射基础麻醉，3％戊巴比妥钠20 mg•kg-1术前和术中间断静脉注射强化麻醉。备皮及皮肤消毒后穿刺股动脉，插入6 F动脉鞘，注入肝素150~200 U•kg-1，常规行冠状动脉造影，为避免局部药物释放干扰，对同一头猪左前降支中段及回旋支各植入2枚相同类型的支架，支架球囊与血管直径比值为(1.1~1.2)∶1，10~15 atm(1 atm=101.325 kPa)扩张30 s，形成冠状动脉狭窄模型［2］。术后每日喂阿司匹林100 mg、氯吡格雷75 mg，并予普通饮食喂养。

1.4 支架内再狭窄的分析

术后第28天行冠状动脉造影后处死动物，剥离冠状动脉，固定24 h后切片、染色。对内膜、中膜和外膜进行组织学分析，应用计算机图像分析系统测定血管狭窄程度。

1.5 免疫组化测定增殖细胞核抗原（PCNA）

组织切片脱蜡至水，用3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，PBS洗涤，置入柠檬酸盐缓冲液中放入微波炉，95 ℃维持10 min。滴加1∶50稀释的鼠抗人PCNA(DaKo公司产品)4 ℃过夜，PBS洗涤后滴加EnVision TM试剂(DaKo公司产品)，37 ℃放置30 min,PBS洗涤，滴加0.05% DAB后再加0.01% H2O2，显色5～15 min，镜下控制终止显色反应。最后苏木素衬染，常规脱水，封片镜检。每个标本观察8个高倍镜视野，计数阳性细胞数占总观察细胞数的百分比。

1.6 TUNEL法测定VSMC凋亡

组织切片常规脱蜡，加入蛋白酶K(20 U•ml-1),消化后洗涤，滴加TUNEL标记液(Roche公司产品)，TdT酶和荧光素标记的dUTP混合液(1∶29),37 ℃湿盒中孵育1 h，PBS洗涤。缓冲甘油封片，置荧光显微镜下观察。计算VSMC的凋亡数(取10个视野的平均值)。

1.7 统计学方法

两组数值均采用x-±s表示，两组间用独立样本t检验，用SPSS 12.0统计软件进行分析。

2 结果

2.1 支架植入情况

6只猪均成功在左前降支及左回旋支冠状动脉中段各植入支架2枚，支架植入术后即刻行冠状动脉造影证实管腔通畅，无充盈缺损、管壁夹层、栓塞、支架移位或远端冠状动脉痉挛，无急性血栓形成。所有动物均顺利完成术后第28天的复查。

2.2 支架植入第28天冠状动脉内膜增殖情况

见表1。TES组与BMS组相比，支架内面积无显著差异。但管腔面积、新生内膜面积、平均面积狭窄百分比两组间比较差异有统计学意义(P

2.3 PCNA及平滑肌细胞凋亡情况比较

TES组内膜PCNA阳性率较BMS组明显减少［(17.00±2.28)% vs (22.83±1.94)%］，差异有统计学意义(P

3 讨论

川芎嗪是中药川芎(ligusticum Chuanxiong)的有效成分四甲基吡嗪，它具有多种药理作用，可以与其它中药组成方剂，广泛用于高血压、冠心病等的防治。已有临床试验证实，PCI术后经6～12个月随访，口服芎嗪组再狭窄发生率明显低于对照组，提示口服芎嗪具有防治PCI术后再狭窄的良好临床效果［3］。动物实验亦显示，TES组与BMS组相比，新生内膜面积明显减少，管腔面积明显增大，TES能抑制内膜增殖，无致栓性，具有良好的生物相容性［4］。PCI术后由于内皮损伤，VSMC增殖并呈激活状态，细胞凋亡减少，PCNA、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、血小板源生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、Bcl-2和c-myc的表达增高，而Bax表达降低。血管内皮损伤后VCMC的迁移、增殖、凋亡及细胞外基质的分泌和堆积，受到多种细胞因子、生长因子和基因调控的介导，参与了局部血管重建和再塑过程［5］。而川芎嗪具有典型钙离子拮抗剂的特性，通过拮抗Ca2+,降低细胞内钙调蛋白(CaM)、钙调神经磷酸酶(CaN)活性，干预CaN依赖的信号转导途径，进而下调细胞内c-myc、PCNA表达水平，从而显著抑制VSMCs增殖［6］。c-myc基因表达DNA结合蛋白，可促进与细胞增殖有关的基因开放，从而产生细胞增殖效应，c-myc基因的激活被认为是增殖的始动环节之一，而川芎嗪能够抑制凝血酶诱导的VSMC表达c-myc基因［7］。川芎嗪通过抑制VSMC Ⅰ型和Ⅳ型胶原、FGF、PDGF表达，抑制c-myc基因表达，达到抑制VSMC增殖的作用［8］。VSMC迁移增殖的前提是局部基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)活性增强，降解VSMC周围的细胞外基质。MMP的活性可被组织型金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)所抑制，局部过表达TIMP可以抑制新生内膜的形成［9］。而川芎嗪具有提高受损动脉管壁TIMP-1 mRNA表达的作用，因此推测川芎嗪通过增加受损动脉管壁TIMP-1 mRNA表达来提高TIMP-1含量，拮抗MMPs对细胞外基质的降解，从而在早期抑制新生内膜的形成［10］。平滑肌细胞中骨桥蛋白mRNA的表达量与平滑肌细胞的迁移能力有密切关系，PDGF刺激了骨桥蛋白mRNA高表达，其中PDGF-BB作用是最强的，川芎嗪也可以通过下调PDGF-BB刺激的骨桥蛋白mRNA的表达，削弱VSMC的迁移能力而防治PCI后再狭窄的发生［11］。本实验亦证实，内膜PCNA阳性率TES组较BMS组明显减少，提示TES可以抑制新生内膜VSMC的增殖及迁移。

支架植入的早期VSMC增殖活性较高，后期伴随VSMC的持续增殖，逐渐出现VSMC凋亡，从而抑制VSMC的进一步增加，提示在支架植入后早期阶段对凋亡进行适当的诱导有可能抑制支架内再狭窄的发生［12］。细胞凋亡的调节有赖于促凋亡基因(如bax、bad)和抗凋亡基因(如bcl-2、bcl-x1)的平衡。内皮损伤后Bcl-2的表达增高，而Bax表达降低，川芎嗪通过抑制bcl-2的表达，促进Bax的表达，从而促进VSMC的凋亡［5］。本实验亦证实，TES组较BMS组单位面积内VSMC凋亡数明显增加，提示TES能够诱导VSMC凋亡。

由本实验可知，TES通过抑制VSMC增殖、迁移并促进VSMC凋亡的作用，降低支架植入术后再狭窄的发生，这是一种防治再狭窄的新策略。

［参考文献］

［1］Pfisterer M， Brunner-La H P， BUSER P T， et al. Late clinical events after clopidogrel discontinuation may limit the benefit of drug-eluting stents: an observational study of drug-eluting vs. bare-metal stents［J］. J Am Coll Cardiol， 2006，48(12): 2584-2591.

［2］袁晋青，高润霖，宋来凤，等.小型猪冠状动脉置入过大直径支架建立再狭窄动物模型［J］.中国循环杂志，1999，14(5): 283-285.

［3］刘玉洁，孙根义，刘志勇，等.川芎嗪防治冠心病经皮冠状动脉介入术后再狭窄的临床研究［J］.中国心血管杂志，2004，9(2):90-92.

［4］陈立娟，马根山，，等.川芎嗪涂层支架生物相容性的实验研究［J］.现代医学，2006，34(6)：371-374.

［5］冯津萍，陈星，陈敏荔，等.血管内皮损伤后血管平滑肌细胞增殖的机制［J］.中华急诊医学杂志，2005，14(9)：727-730.

［6］郑红花，罗德生，李映红，等.川芎嗪对Ang Ⅱ诱导的大鼠VSMCs 增殖的干预作用［J］.医学杂志，2006，31(11)：1082-1086.

［7］王宏伟，张露，赵华月，等. 川芎嗪对血管平滑肌细胞增殖及表达c-myc 基因的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2000,8(4)：319-321.

［8］冯津萍，卢奕，陈星，等.川芎嗪对血管平滑肌细胞增殖抑制作用的探讨［J］.中草药，2007，38(1)：92-95.

［9］Furman C， Luo Z， Walshb K， et al.Systemic tissue inhibitor of metalloproteinase-1 gene delivery reduces neointimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery［J］. FEBS Lett， 2002，531(2): 122 -126.

［10］李敬文，刘相轸，刘晓谦，等.川芎嗪对颈动脉球囊损伤后基质金属蛋白酶组织抑制物-1基因表达的影响［J］.中国微侵袭神经外科杂志，2004，9(7)：314-317.

［11］张健，蔡生业，姚成芳，等.川芎嗪对PDGF-BB诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和骨桥蛋白mRNA 表达的影响［J］.山东中医药大学学报,2005， 29(3)：230-232.

［12］张新霞，崔长琮，李江，等.家兔颈动脉内支架置入后细胞凋亡的动态观察［J］.西安医科大学学报，2001，22(4):325-327.

［收稿日期］2008-01-08