荧光RT—PCR法快速检测微量建兰花叶病毒研究

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摘要 根据基因库中建兰花叶病毒外壳蛋白基因的保守序列，设计并合成3对特异性引物，利用荧光rt-pcr方法在蜘蛛兰中检测到普通RT-PCR-琼脂糖电泳法检测不到的微量病毒。熔解曲线分析表明，每一扩增产物为单一产物形态。通过测序和同源性分析，试验证实扩增产物序列的实际长度与预期完全相符，蜘蛛兰样品的扩增产物基因序列与基因库中建兰花叶病毒相应序列的同源性为94%～96%。与普通RT-PCR的相比，荧光RT-PCR方法具有灵敏度高、操作快速、结果直观准确的特点，可应用于种苗中微量建兰花叶病毒的早期检测。

关键词 建兰花叶病毒；荧光RT-PCR；快速检测；蜘蛛兰

中图分类号 S682.31；S432.41；S188 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2011）21-0176-04

Rapid Detection of Trace Amounts of Cymbidium Mosaic Virus by Real-Time RT-PCR

LIU Ai-chun LIU Chao LI Feng

（ Hangzhou Academy of Agricultural Sciences in Zhejiang Province，Hangzhou Zhejiang 310024）

Abstract According to the conserved sequence of the coat protein gene of Cymbidium mosaic virus（CymMV）in the GeneBank，three pairs of primers used in real-time RT-PCR methods were designed and synthesized for detecting traces of the virus which could not be detected by ordinary RT-PCR-Agarose gel electrophoresis in spider orchid（Arachnis sp.）. Melting curve analysis showed that each amplified product was a single product form. Sequencing and homology analysis indicated that the actual sequence lengths of the amplified products were entirely consistent with expectations，and the amplified gene had between 94% to 96% homology with the corresponding gene of CymMV in GeneBank in spider orchid. Compared to ordinary normal RT-PCR，the real-time RT-PCR method characterized by high sensitivity，fast operation，intuitive and accurate，is suitable for detection of trace amounts of CymMV and early diagnosis in seedlings.

Key words Cymbidium mosaic virus；real-time RT-PCR；rapid detection；Arachnis sp.

建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，简称CymMV）和齿兰环斑病毒（OdontogLossum ringspot virus，简称ORSV）是发生最为普遍的兰花病毒，广泛分布于全世界栽培兰花的地区[1-6]，这2种病毒传染性强，其中CymMV相对ORSV更易传染，在市场上蝴蝶兰、文心兰和卡特兰CymMV的感染率高达66%以上[7]，病毒侵染导致植株生长不良甚至死亡，有时病毒感染后还会在植株的营养生长期出现较长时间的隐症现象，但带毒植株开花小而少，花期缩短，发病兰株观赏价值和经济价值大为下降，还会导致种质退化，对兰花产业造成严重危害。

多年来，国内学者不断深入地对CymMV的检测技术开展研究工作：1997年，潘俊松等[8]从石桷兰中分离出CymMV用于制备抗血清；郑 平等[9]用组织涂抹酶联免疫吸附技术检测CymMV和ORSV；周国辉等[10]用RT-PCR方法对病毒分子进行鉴定；2007年施农农等[11]对用电镜法对CyMV和ORSV进行超微结构观察；2008年高焕利等[12]用IC-RT-PCR检测CymMV，提出了该方法可检测到CymMV分离物的最低病毒量为2.72 ×10-7 μg/mL（428 个拷贝）。2006—2008年期间，笔者在根据文献资料的多种方法对147个样品进行CymMV检测，并相应的隔离栽培，但不时发现有部分初检为阴性的样品，经过一段时间养护后复检为阳性，对苗圃中兰花种苗的检测也经常发现这种情况。这就涉及检出限的问题，说明有部分样品中只含有微量CymMV，用前述的方法不能被检出。

为解决检测工作中由于隐症、病毒浓度低、干扰物质存在而影响检测结果的问题，笔者摸索建立了利用实时荧光PCR仪快速检测微量建兰花叶病毒的方法，使建兰花叶病毒的检测水平从灵敏度、准确性、稳定性上有所提高。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料。供试材料为蝴蝶兰（PhaLaenopsis sp.）（1#）、卡特兰（CattLeya sp.）（2#）、文心兰（Oncidium sp.）（3#）、蜘蛛兰（Arachnis sp.）（4#）、皇后兰（GrammatophyLLmn sp.）（5#）、蕙兰（C.Faberi）（6#），所有样品之前经ELISA筛检，并由笔者所在实验室分类保存，其中本试验所用的卡特兰、文心兰和蜘蛛兰为加保护液冻存的叶片组织，其他为从植株上采的新鲜叶片。

1.1.2 供试试剂。供试试剂为：UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒（上海Sangon），MMLV一步法RT-PCR扩增试剂盒（上海Sangon）、One Step SYBR PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒（大连Takara公司）。

1.1.3 供试仪器。供试仪器为：Bio-Rad Opticon 2荧光定量PCR仪（美国），Thermo Labsystem MuLtiskan Mk 3酶标仪（上海雷勃），TC-96/H/G基因扩增仪（大和热磁），VARIAN CAR Y50紫外-可见分光光度计（美国）。

1.2 引物设计与合成

查询NCBI基因库（GeneBank），根据CymMV保守序列，设计并合成3对特异性引物（表1）。

1.3 RNA提取

样品用液氮研磨成粉状，称取粉状未解冻试样（约为100 mg），提取步骤参照RNA抽提试剂盒推荐方法稍加调整，因试样较粘稠，每100 mg试样加0.8 mL裂解液提取，洗脱体积为50 μL。取20 μL RNA提取物用无菌水稀释100倍在分光光度计上以波长260 nm检测总RNA含量，以A260/280比值和200～400 nm扫描图检测RNA纯度，纯化提取物直到A260/280比值>1.9。将提取物10 μL/管分装在RNAase free的PCR管中，-80 ℃保存备用。

1.4 普通RT-PCR-琼脂糖电泳定性检测熔解曲线分析

将1.3提取的兰花RNA用MMLV一步法RT-PCR扩增试剂盒，反应条件参照文献[7]。反应结束后，取C1、C4、C7产物分别为4.0、5.0、6.0 μL，各加0.5 μL上样缓冲液，于1.2%琼脂糖凝胶上（含EB 0.2 μL/mL ）进行电泳。

1.5 荧光RT-PCR定性检测和熔解曲线分析

将1.3提取的兰花RNA用One Step SYBR PrimeScript TM RT-PCR试剂盒进行荧光PCR定性检测，具体操作步骤：每孔加RT-PCR Buffer（内含dNTP Mixture，Mg2+，SYBR？誖Green I）25 μL，反转录酶和Taq酶混合物2.0 μL；10 μmoL/L上游、下游引物（C7）各1.0 μL；水20 μL；最后加1.0 μL标准品或试样，制成总体积为50 μL反应液体系，以无菌水代替试样作空白对照，加盖密封，1 000 r/min离心1 min，在荧光PCR仪上逆转录和扩增反应，经优化后的一步法RT-PCR反应条件为：①43 ℃，30 min；②94 ℃，15 s；③94 ℃，5 s；④55 ℃，30 s；⑤72 ℃，20 s；⑥读板；⑦将③～⑥步PCR反应循环30次；⑧72 ℃，5 min。将扩增产物进一步做熔解曲线分析：55～94 ℃；每0.5 ℃读板1次，每点持续5 s。

1.6 荧光RT-PCR定量检测

由于普通RT-PCR与荧光PCR定性检测存在差异，对有差异结果通过与一定浓度的重组质粒同时扩增进行定量分析。

1.6.1 标准品的制备。将得到的经纯化的扩增产物，与质粒（pUCm-T载体）连接并克隆，提取相应的重组质粒，制成100 ng/mL的溶液，以此作为标准品储备液。

1.6.2 一点法粗略定量检测。将C4重组质粒储备液以无菌去离子水逐级稀释成2.8×102质粒/μL标准使用液。4#样品和标准品在相同条件下进行反应：RT-PCR Buffer 12.5 μL，反转录酶和Taq酶混合物1.0 μL；10 μmoL/L上游、下游引物（C4）各0.5 μL；水10 μmoL；最后加0.5 μL标准品或试样，制成总体积为25 μL反应液体系，反应条件为：①43 ℃， 30 min；②94 ℃，2 min；③94 ℃，30 s；④、55 ℃，30 s；⑤72 ℃，25 s；⑥读板；⑦将③～⑥步PCR反应循环35次；⑧72 ℃，10 min。

1.6.3 绝对定量法检测。将C7重组质粒储备液以无菌去离子水逐级稀释成2.6×107、2.6×105、2.6×102质粒/μL的标准使用液。将1#、4#和5#样品和标准品在相同条件下进行反应，引物为C1，其他反应试剂同1.62，反应条件参照文献[13]。对线性范围内未知样品用绝对定量法计算其原始拷贝数，对线性范围以下的样品进行半定量分析其浓度范围。

1.7 测序验证

收集1.4和1.6的扩增产物，经纯化、克隆，委托上海Sangon测序。

2 结果与分析

2.1 CymMV 的普通RT-PCR-琼脂糖电泳定性检测结果

用所设计3对的CymMV PCR 引物进行RT-PCR 反应，能够成功地在部分兰花病样总RNA 抽提物中扩增到与预期大小相符的单一明亮的DNA电泳条带（图1）。由图1可见4#样在电泳图上未检出CymMV，但该植株再经过3个月的隔离栽培后出现症状，并用ELISA和PCR方法均检出CymMV，随后逐渐枯死。

2.2 荧光RT-PC定性检测结果

由图2可知，4#样的总RNA提取物经荧光RT-PC定性检测发现该蜘蛛兰已被CymMV感染，但其含量极低，对产物进一步进行熔解曲线分析，结果4#样与其他样品的产物Tm都是78.0 ℃，并由图3可知，其熔解曲线均为单一产物形态，表明4#样与其他样品的具有相同的单一产物。

2.3 荧光RT-PCR半定量检测结果

由图4可知，4#样的CymMV C4模板浓度

2.4 测序结果

测序结果表明，所有扩增产物的实际长度与预期完全相符。应用NCBI基因库的BLAST对产物进行同源性分析，C1产物与基因库中CymMV相应序列的同源性≥96%；C4产物同源性89%～99%。C7产物的测序结果同源性比较见图6，由图6可知，1#样蝴蝶兰同源性≥96%；5#样皇后兰同源性≥97%，与AM055640.2所报道的序列完全相同，与1#样有5个碱基的差异（同源性97%）；4#样蜘蛛兰与基因库序列的同源性94%～96%；与基因库中EU672821.1序列最接近，存在7个碱基的差异（同源性96%）；4#样与1#样有12个碱基的差异（同源性94%），4#样被其他样品污染的可能性极小。因此，认为该植株在引进时已经携带微量的CymMV。

3 结论与讨论

3.1 建立了微量CymMV的快速检测方法

传统的PCR-电泳方法无法对起始模板准确定量，只能对终产物进行分析，必须在扩增后用电泳方法分析，费时费力，而且电泳分辨率限制了该方法的检测灵敏度。

荧光RT-PCR法在检测时可进行实时观察扩增状态，因此在很大程度上加快检测速度；该方法因所有试验在封闭系统内完成，可变因素大大减少，比普通PCR方法灵敏度提高了102倍；因为不需要进行后期处理，可防止强致癌物溴乙锭对操作人员的危害。本研究建立的CymMV实时荧光RT-PCR检测方法具有灵敏度高、操作快速、结果直观准确的特点，可应用于种苗中微量CymMV的早期检测，并对深入开展CymMV生物学特性研究打下基础。

3.2 检测灵敏度可达基因拷贝数仅在个位数

荧光RT-PCR检测方法不但可以定性分析，也可进行定量分析，导入基因拷贝数解析，在本文中主要针对病毒含量在定量限（2.6×102拷贝）以下的样品进行分析，因此只能通过半定量方法推算其基因拷贝数仅在个位数。

3.3 荧光RT-PCR定性和绝对定量检测对引物要求高

荧光PCR法的荧光扩增曲线，不能分辨扩增产物有几个，因此必须是单一产物的扩增。扩增结束时，可用熔解曲线法对扩增的特异性进行验证。因此，要求引物具有高度的特异性和目标基因的保守性。

荧光RT-PCR定量检测方法分为绝对定量和相对定量法，相对定量法检测成本高，本研究主要针对生产应用，因此，采用了绝对定量法，该种方法对于引物的特异性、保守性和产物的稳定性要求较高，所应用的引物应经过反复验证。

本该研究中，最初设计了7对引物，其中C1和C7互为巢式扩增引物，就是为了防止出现非特异性扩增而设计的。经反复试验从中筛选出3对符合要求的引物：C1、C4和C7。这3对引物中，C1和C7的产物保守性相对较高。C7产物序列较短，扩增快速度快，定性快速检测时宜选用C7引物；在定量检测时，C1产物通过与质粒连接作为标准品，可获得较好的定量效果[13]；C7引物的定量方法有待进一步研究。

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