硝基苯降解菌Bacilluscereusyc11—1的鉴定及降解条件优化

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摘要： 鉴定了从处理硝基苯废水的人工湿地中分离出的一株降解硝基苯的优势菌yc11-1，并采用中心复合设计法优化影响菌株降解硝基苯的因素来提高菌株对硝基苯的降解率。经形态学和菌株的16S rDNA序列分析，菌株yc11-1为蜡质芽孢杆菌（Bacillus cereus）。该菌株降解硝基苯的最佳条件为初始硝基苯浓度84.84 mg/L、菌种投加量12.97%、培养温度29.4 ℃和pH 7.1，在此条件下理论降解率可达91.14%，实际降解率为90.58%。

关键词：硝基苯；蜡质芽孢杆菌；降解；中心复合设计

中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）16-3824-03

硝基苯（Nitrobenzene，NB）为芳烃类化合物，是有机合成的重要中间体及用作苯胺生产的原料。环境中的硝基苯主要是由人类生产活动过程中释放[1]。硝基苯属于低毒污染物，但由于硝基苯属于易燃易爆的危险物质，容易产生环境污染事件，很多国家和组织都将硝基苯作为优先污染物记录在案[2-5]。硝基苯可以通过多种途径进入环境，在中国河流中被广泛检出，某些达标排放的排污口或排污口附近还是可能存在较大的生态风险[6]。微生物降解法是处理含中低浓度硝基苯类废水的重要方法，其克服了物理法和化学法处理废水的低效、高成本和易产生二次污染的缺点[7-9]。微生物降解法的关键是用于降解的微生物，目前一些能够降解硝基苯类化合物的微生物得到了分离[10-14]，但是它们的降解效率不高。研究鉴定了一株从含硝基苯废水污灌的人工湿地中分离得到的降解优势菌yc11-1，并通过中心复合设计法对该菌株降解硝基苯的条件进行优化，考察了各因素及其交互作用对硝基苯降解率的影响，并得到降解硝基苯的最优条件，为菌株yc11-1的深入研究和应用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 菌株yc11-1从处理硝基苯的人工湿地中分离、筛选得到，保存待用。

1.1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，琼脂20 g，NaCl 5 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0～7.2。LB培养基：酵母膏5.0 g；蛋白胨10.0 g；NaCl 5.0 g；去离子水1 000 mL；pH 7.0～7.2。无机盐培养基：K2HPO4 4.35 g；KH2PO4 1.7 g；NH4Cl 2.1 g；MgSO4 0.2 g；MnSO4 0.05 g；FeSO4·7H2O 0.01 g；CaCl2·2H2O 0.03 g；去离子水1 000 mL。按需调节pH，按需添加硝基苯。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分类鉴定 参照《伯杰细菌鉴定手册》[15]对菌落形态及个体特征进行鉴定。培养24 h的菌株用磷钨酸钠染色，OLYMPUS BH-2型光学显微镜直接对菌落进行观察，JEM-1200EX型透射电镜进行形态观察。16S rDNA基因片段的PCR扩增参照Kahng等[16]的方法进行，PCR产物纯化后委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。在核酸序列数据库（GenBank）中进行Blast同源性序列比对，根据同源序列搜索结果及构建的菌株系统发育树，确定菌株的分类地位。

1.2.2 菌种的培养、接种和硝基苯降解 斜面菌种接种至100 mL LB培养基中，在30 ℃、120 r/min下振荡培养24 h，菌体达到对数生长期后于4 ℃ 6 000 r/min离心5 min，收集菌体，用生理盐水洗涤3次，悬浮于无菌水中配制成1×109 CFU/mL的菌悬液。菌悬液按照设计的接种量添加到100 mL无机盐培养基中，培养72 h后，测定硝基苯的降解率。每个试验5个平行，取平均值作为测定结果。

1.2.3 硝基苯浓度测定 硝基苯浓度测定采用气相色谱法。取菌液40 mL转移至离心管中，4 ℃ 8 000 r/min离心15 min。将25 mL上清液转移至分液漏斗中，用5 mL苯萃取15 min。将萃取液用0.45 μm孔径的尼龙膜过滤后气相色谱测定。色谱柱采用DB-5 MS色谱柱（30 m×0.25 mm，J&W Scientific，USA），以高纯氮气作为载体，流速为1.0 mL/min。进样口和检测器温度分别为260 ℃和290 ℃，采用无分流方式进样，进样量1.0 μL。程序升温设为：初始柱温70 ℃（3 min），30 ℃/min升温到280 ℃。

1.2.4 降解试验设计 根据前期试验结果，选取对硝基苯降解有显著影响的初始硝基苯浓度、菌种投加量、培养温度和pH 4个因素作为主要考察因素（自变量），分别以X1、X2、X3、X4表示，每个因素取3个水平，以-1、0、1编码，根据前期最陡爬坡试验结果确定各个水平的值（表1）。中心复合法（Central composite design，CCD）设计为4因素2区组28个处理，用SAS 8.0软件对试验数据进行回归拟合，并对拟合方程作显著性检验；绘制对硝基苯降解率具有显著影响的响应曲面，分析考察影响因素及其交互作用对硝基苯降解率的影响；最后在一定范围内求取各因素的最适值，得到菌株yc11-1降解硝基苯的最优条件。

2 结果与分析

2.1 菌株的分类地位

2.1.1 形态特征 菌株yc11-1接种在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上25 ℃培养48 h，菌落呈乳白色，圆形，中部稍凸起，边缘不整齐，湿润（图1A）；菌体革兰氏染色阳性，显微镜观察菌体呈杆状，大小约为1.0 μm×1.2 μm，周生鞭毛，可运动（图1B）。

2.1.2 线粒体16S rDNA序列分析 菌株yc11-1 16S rDNA扩增得到1 380 bp序列，在GenBank中进行Blast比对，构建系统发育进化树。yc11-1的16S rDNA序列与芽孢杆菌属的一株蜡质芽孢杆菌Bacillus cereus Hs2-17（JF899264）的16S rDNA序列相似性为98.2%。根据形态学特征与16S rDNA分析结果，确定菌株yc11-1为芽孢杆菌属蜡质芽孢杆菌（Bacillus cereus）。

2.2 降解条件优化结果

2.2.1 回归方程的建立及显著性检验 采用最小二乘法对表2中的试验数据进行多元回归拟合，得二次多元回归方程模型：

Y=90.50+1.94X1-1.35X12+1.17X2-0.35X22+1.08X3-2.24X32+0.74X4-0.50X42-0.73X1X2- 0.39X1X3-0.21X1X4-1.10X2X3-0.28X2X4+ 0.11X3X4，R2=0.968 8 （1）

式中，Y为硝基苯降解率（%）。

回归方程的显著性检验结果见表3。由表3可知，失拟项不显著（P>0.05），且方程决定系数R2=0.968 8，说明该模型拟合度很好，可以用来描述Bacillus cereus yc11-1对硝基苯的降解。回归方程一次项X1极显著，X2、X3、X4显著；二次项X32极显著，X12显著；交互项X2X3显著，其他交互项均不显著。由此可见，所选4个试验因素与响应值之间不是简单的线性关系。菌种投加量（X2）和培养温度（X3）具有显著的交互作用。利用SAS 8.0软件，作出初始硝基苯浓度80 mg/L和pH 7.0水平时菌种投加量和培养温度的响应曲面（图2）。从图2可以看出，培养温度的适度升高可弥补菌种投加量的不足，提高硝基苯的降解率。这是因为细菌的生长都有其适宜的温度范围，适当提高培养温度有利于细菌的繁殖，从而增加有效微生物的数量。

2.2.2 硝基苯降解最优条件的确定 根据SAS 8.0软件中的最优分析得出硝基苯降解率取得最大值的条件为初始硝基苯浓度84.84 mg/L，菌种投加量12.97%，培养温度29.4 ℃和pH 7.1，在此条件下硝基苯的理论预测降解率为91.14%。

2.2.3 验证试验结果 为验证响应曲面法所得结果的可靠性，在上述最优条件下进行硝基苯的降解试验，5次重复，实际测得硝基苯降解率平均值为90.58%，试验值在预测值99%的置信区间内，从而表明采用响应曲面法得到的最优条件准确可靠，具有很好的实践指导作用。

3 小结

从硝基苯污灌的人工湿地中分离出一株硝基苯降解菌，通过形态特征和16S rDNA的核酸序列分析鉴定为蜡质芽孢杆菌，并命名为Bacillus cereus yc11-1。采用中心复合法对Bacillus cereus yc11-1降解硝基苯的条件进行设计，得到降解硝基苯的最优条件：初始硝基苯浓度84.84 mg/L，菌种投加量12.97%，培养温度29.4 ℃和pH 7.1，在此条件下硝基苯的理论预测降解率为91.14%。试验结果经验证是准确可靠的。

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