PARP介导氧化应激与糖尿病视网膜病变的研究进展
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[摘要] 糖尿病视网膜病变（DR）因其发病率高、病情严重而倍受人们关注，氧化应激能通过各种途径损伤糖尿病的视网膜。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（parp）是目前国外研究较热的一种酶，并有较多实验证据表明PARP能介导氧化应激并参与糖尿病视网膜疾病的发生。该文就PARP在DR发病中的作用做一综述。
[关键词] 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 氧化应激 糖尿病视网膜病变
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是一种严重的糖尿病并发症，目前在经济发达国家已成为成人致盲的主要原因。高血糖会导致活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)过量产生，使多个组织发生氧化应激，而氧自由基则可以通过糖基化终末产物(AGEs)等多条途径参与DR的损伤过程。最近有研究表明，氧化应激最终有可能是通过激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(poly ADP-ribose polymerase，PARP)而发挥作用的[1]，而PARP抑制剂的使用为DR的治疗带来新的前景。
1 PARP的结构与功能
1.1 PARP的结构
聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 (poly ADP-ribose polymerase，PARP)是一类存在于多数真核细胞中的催化聚ADP核糖化的核酶。PARP最早于1963年由法国斯特拉斯堡Mandel小组在肝细胞核中发现[2]。它主要存在于细胞核内，少量存在于细胞浆内[3]。目前研究发现，PARP家族至少有：PARP-1、PARP-2、PARP-3、PARP-4/VPARP、Tankyrase-1和-2 6个成员。PARP-1是PARP家族中最早被发现，而且特性了解最清楚的成员。它是由1014个氨基酸残基组成的一条多肽链， 分子量为116 kDa，含有3个功能性结构域：DNA结合结构域(DNA binding domain，DBD，46kDa)，自身修饰域(the automodification domain，AMD，22kDa)和C-端催化域(catalytic domain，54 kDa)。其中DBD含两个锌指结构(Zn-finger)及核定位信号（nuclear localization signal，NLS），这两个锌指结构参与识别DNA缺口，第1个锌指识别DNA单链和双链断裂，它的突变会降低PARP的激活；第2个锌指只参与DNA单链断裂的识别，NLS含有与凋亡相关的DEVD模体。AMD能使ADP与糖基结合，发生PARP自身糖基化，并使PARP形成二聚体。C-末端的催化结构域含有NAD+结合位点，能把NAD+转化为ADP核糖，此序列高
度保守[4、5]。
1.2 PARP的功能
PARP具有维持染色体结构完整，参与DNA复制和转录的功能，在维持基因组稳定和细胞死亡过程中发挥作用。DNA断裂可以激发基因重组，PARP能结合到受损DNA的断端从而减少重组发生，并使受损的DNA避免受核酸外切酶的作用而产生重组中间物。PARP在DNA损伤时被激活，作为DNA损伤的分子感受器识别并结合到DNA的断裂部位，从而保护的DNA末端免遭核酸酶的分解，参与DNA的修复[6]。PARP还能通过协调DNA修复与DNA复制、转录、细胞周期的推进之间的关系，来促进DNA修复[7]。
PARP激活促进DNA的修复，但过度的PARP活化将引起细胞能量耗竭而死亡。Lin等研究发现，在PARP的催化下，每转化一个ADP核糖，需要消耗2个ATP才能从尼克酰胺再合成一分子的NAD+，尼克酰胺转化成尼克酰胺单核苷酸(NMN)需要消耗5-磷酸-α-D-核糖-1-焦磷酸和一个ATP，NMN再转化为NAD+又需要另一个ATP。这样，PARP的过度活化可以导致无谓的NAD+转化和ATP消耗。NAD+的消耗也能通过降低糖酵解和氧化磷酸化的方式减少ATP[8]，最终导致细胞死亡。
2 PARP与细胞氧化损伤
2.1氧化应激损伤引起线粒体DNA（mtDNA）损伤的机制
2.1.1自由基介导的mtDNA损伤
自由基主要来源于线粒体氧化磷酸化过程，是线粒体正常代谢的副产物，由线粒体电子传递链产生，但是过量的自由基产生便会损伤线粒体。自由基可以广泛攻击体内生物大分子。由于mtDNA缺乏组蛋白，与氧化磷酸化场所(线粒体内膜)相距甚近，复制快速且无校读功能以及缺乏有效的DNA修复机制，所以mtDNA较易受自由基攻击、氧化损伤而引起突变，其突变率是核DNA的10倍。
自由基通过攻击mtDNA的碱基和糖基，最终可导致mtDNA的点突变、缺失和插入突变，其中以片段缺失多见。氮氧自由基还可以使DNA脱氨基并诱导其突变，并增强线粒体对氧化应激的敏感性。当线粒体受到损伤，内膜通透性增加时，线粒体释放细胞色素C和凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)，诱导细胞凋亡。
2.1.2 脂质过氧化导致mtDNA损伤
Nakayama等在1984年发现α-生育酚（维生素E）可通过将氢给予脂质自由基而抑制DNA自由基的形成。两年后，他又发现α-生育酚可以阻止甲基亚麻酸过氧化氢(methyl linoleate hydroperoxide)诱导的DNA损伤。Andrew M.H于1988年观察到α-生育酚可同时阻止脂质过氧化和DNA损伤。尽管脂质过氧化作用诱导mtDNA损伤的确切机制并未得以阐明，但可以推测脂质过氧化过程中产生的LO•、LOO•等自由基可以发挥类似•OH对DNA的攻击作用。
线粒体是机体能量的主要产生场所，机体内80%以上的能量产生于线粒体。由于线粒体是机体的“动力工厂”，mtDNA损伤可导致线粒体功能缺陷，引起细胞能量不足而造成细胞的衰老与死亡。 氧化应激通过以上各种途径攻击mtDNA，导致mtDNA链断裂等改变，进而激活PARP，从而引发后续的一系列生化反应。
2.2 PARP对DNA的损伤和保护作用
PARP-1参与调节DNA的修复、基因组完整性的维持及在转录复制分化水平上各种蛋白质的表达。适度的细胞损害可以造成安全范围内的细胞死亡，这些细胞死亡是由凋亡及严重的DNA损害所导致的不可逆转的死亡。轻微的DNA损害刺激了PARP-1，这有利于DNA的修复及细胞的存活。然而，过度的PARP激活则导致细胞坏死。如过氧化亚硝酸盐（ONOO-）等诱导的氧化和/或硝硫氰酯应激常常导致大量的DNA断裂，ONOO-能够潜在触发DNA链的断裂及继发的PARP的激活。缺血/再灌注损伤与氧化及硝硫氰酯应激有关，最终也能导致PARP的激活，耗竭与之相关联的NAD+及ATP，这种耗竭导致细胞功能异常并最终发生坏死，坏死的细胞释放炎症介质，进一步加重周围组织损伤。PARP作为凋亡与坏死之间的分子开关的作用，已经在给予PARP抑制剂的大鼠实验中被证实，PARP抑制剂能在氧化应激的细胞中抑制或灭活PARP并能保存细胞中的NAD+及ATP。在这种情况下，细胞能保持正常的形态，保护细胞避免坏死。
PARP的另外一个作用就是参与氧化损伤DNA蛋白的降解、清除，避免进一步损伤细胞。蛋白酶体系统是一类能降解、清除氧化损伤蛋白的物质，在维持细胞内正常的代谢环境中起重要作用。研究表明，PARP-1在ROS中的作用是诱导白酶体的激活，poly-(ADP-ribose) (pADPR)、PARP 及20S白酶体之间的相互作用增强了酶的活性。PARP-1能干扰白酶体的非共价键，激活的PARP通过非共价相互作用增加了20S白酶体的蛋白水解活性，从而有利于氧化损伤DNA蛋白的降解、清除。所以，PARP最有可能是DNA修复及氧化蛋白质清除的协调交叉点。
PARP激活的积极及消极方面的作用：PARP的促进细胞死亡及细胞保护作用看上去似乎是相反的两个方面。氧化应激所致DNA的断裂使PARP高度激活，进而导致NAD+及ATP的耗竭及细胞坏死的持续。另一方面，PARP也利于损伤细胞中的DNA修复。
3 氧化应激与糖尿病视网膜病变
在2004年美国召开的糖尿病学会年会中，Brownlee提出：线粒体电子传递链过氧化物产生过量是诱导高血糖血管损伤进而导致诸如DR等糖尿病并发症的共同机制。氧化应激反映的是体内活性氧及氮簇(ROS/RNS)与抗氧化防御系统之间的消长状态。ROS/RNS过多的产生会通过细胞的脂质过氧化作用、蛋白质的氧化及DNA的改变（链断裂及基本结构变形）导致组织的损伤，并作为急慢性疾病（如缺血/再灌注损伤、全身炎症反应综合征、感染性休克、糖尿病、中风及关节炎）的一个主要发病机制。
血糖水平升高能引起细胞线粒体产生大量的ROS、非酶蛋白糖基化以及葡萄糖的自身氧化，从而引起氧化应激。正常情况下，机体通过激活转录因子AP-1、NF-κB等诱导抗氧化酶如：超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等的表达，清除自由基，对细胞产生特异性保护作用。但在高血糖情况下，抗氧化酶的表达受到抑制，视网膜抗氧化系统防御能力减弱。研究发现，在高糖环境中培养视网膜Müller细胞和血管内皮细胞，细胞线粒体中的超氧化物生成增多，导致视网膜内皮细胞凋亡，而使用抗氧化剂如锰超氧化物歧化酶(MnSOD)或者脂质酸能阻止细胞凋亡。在DR早期，NO的合成能被高血糖诱导生成的超氧阴离子抑制，但随即由于NADPH氧化酶的活化、NF-κB的表达上调， 激活了诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，从而合成了大量的NO，并且与超氧阴离子很快合成ONOO-，ONOO-可导致DNA单链断裂，激活PARP，活化的PARP可使ADP-核糖从其底物NAD+解离，转移到自身或其他蛋白，NAD+的耗竭可消耗ATP，导致细胞功能障碍。
氧化应激对视网膜血管内皮细胞、周细胞、神经节细胞和血-视网膜屏障均有影响。研究表明，注入链唑霉素（STZ）的糖尿病大鼠视网膜超氧化物岐化酶水平降低，其他抗氧化物如还原型谷胱甘肽(GSH) 水平下调。GSH等大量消耗，使得视网膜毛细血管内皮细胞处于氧化应激和硝基化应激状态，诱导细胞凋亡，释放致炎因子如血管内皮生长因子(VEGF)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、内皮素-1(ET-1)等，导致早期DR血流动力学改变和微血管病变。Li和Renier发现，在培养牛视网膜血管内皮细胞中，氧化应激损伤可致视网膜内皮细胞活性氧生成增多，同时VEGF表达上调，说明氧化应激与视网膜上VEGF的过度表达有关。El-Remessy等通过比较不同葡萄糖浓度下培养的视网膜内皮细胞，发现高血糖状态下的视网膜内皮细胞产生的硝基酪氨酸增加[27]。在糖尿病大鼠视网膜和高糖培养的视网膜内皮细胞中都可发现NO含量增高，而且NO使血-视网膜屏障通透性增高。在高血糖状态下，氧化应激通过以上各种方式损伤视网膜内皮细胞，损伤的内皮细胞能产生ROS，ROS破坏DNA，导致PARP快速激活。异常活化的PARP会大量消耗细胞内底物NAD+，减慢糖酵解、电子运输、ATP形成及GAPDH的ADP核糖基化作用，使细胞的ATP合成减少，细胞因ATP耗竭能量缺乏而发生坏死，坏死的细胞释放炎症介质，进一步损伤周围组织。另外，PARP还能启动核转录因子如NF-κB，AP-1等，释放大量炎症因子，导致糖尿病视网膜微血管的急性内皮功能障碍，进而引起严重的视网膜病变。
4 PARP与糖尿病视网膜病变
4.1 PARP在糖尿病视网膜中的高表达
最近研究发现，在注入STZ4周的糖尿病大鼠的视网膜神经细胞层中发现PARP的存在。此外，其他研究发现[32]，在注入STZ12周大鼠的视网膜神经细胞层、内核层、外核层及视网膜血管的内皮细胞及周皮细胞的细胞核内亦有PARP的高表达。Irina G等研究表明，PARP抑制剂3-aminobenzamide和1，5-异喹啉能明显抑制糖尿病视网膜上氧化应激导致的MAPK（促分裂原活化蛋白激酶）和NF-κB的激活、ET-1和环氧合酶-2的过度表达及炎症反应。在Zheng等人的研究中，还发现一种PARP抑制剂PJ-34，同样能抑制上述反应。
4.2 PARP激活致糖尿病性视网膜病变的可能机制
Ling Zheng等人在体外研究中发现，高糖浓聚物比普通水平血糖诱导更多的PARP与核转录因子（NF-κB）的p50亚单位结合。与5mmol/L的葡萄糖浓度相比，在提高葡萄糖浓度（25mmol/L）后有更多的PARP被合成p50的亚单位结合。研究表明，牛视网膜血管内皮细胞中被激活的PARP可以直接干扰NF-κB的两个亚单位(p50 和 p65)，并调节它们的转录活性。在高糖环境中，增加p50与PARP之间的相互作用有助于聚集NF-κB的其他共活化物，如组蛋白乙酰转移酶p300，以形成一个转录复合物，调节NF-κB相关基因的表达。另外，有研究发现，PARP参与了NF-κB的激活及炎症因子的表达，包括细胞间粘附分子-1、TNF-β、iNOS等。NF-κB的激活、细胞间粘附分子-1、TNF-β、iNOS与糖尿病所致的血管内皮功能障碍有关。因此，PARP的活化可能部分通过调节NF-κB从而在高血糖导致的视网膜血管内皮细胞的死亡中起重要作用。
5 PARP抑制剂在糖尿病性视网膜病变中的应用
Sugawara等人研究发现，高糖环境下会导致细胞中NF-κB活性的增加，但在PARP活性被抑制的细胞中，NF-κB的活性也下降。PARP抑制剂PJ-34阻止了高血糖所致的NF-κB激活作用的增加。Zingarelli、Salzman和Szabo 等人报道，在PARP活性被抑制的细胞中，细胞粘附分子-1的表达也被抑制。PARP的抑制可能通过抑制NF-κB的活性及细胞间粘附分子的表达，从而抑制了糖尿病视网膜上白细胞的粘附。另外他们还发现，PARP抑制剂能够改善血管内皮功能，从而减少白细胞与受损的血管内皮粘附。在Irina G等的研究中，也证明PARP抑制剂能抵抗STZ-糖尿病大鼠VEGF的过度表达和神经细胞的凋亡作用。而VEGF能增加血管的渗透性及诱导增生性糖网病血管的发生。最近报道，PARP还能够调节与细胞凋亡有关的几种基因，包括caspase-1和caspase-3。但是至于哪一种细胞凋亡基因在糖尿病视网膜疾病中被激活及PARP如何调控它们还有待进一步研究。
6 展望
糖尿视网膜病变是眼科的常见病、多发病，但目前尚无有效的治疗方法来逆转DR的发展与转归。糖尿病大鼠视网膜微血管PARP活性明显增加，给予PARP抑制剂如PJ34治疗后，可纠正糖尿病内皮细胞的功能紊乱，视网膜病变显著改善。虽然PARP在DR发病机制中的具体作用还有待进一步研究，但目前研究已经发现PARP抑制剂在改善糖尿病视网膜病变上起着不可忽视的作用，有望在改善DR的发生和预后中发挥更大的作用，为DR的预防和治疗上带来新的希望。
参考文献
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