穿山龙中薯蓣皂苷元的提取分离及测定方法研究概况
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摘 要：对穿山龙中薯蓣皂苷元的提取分离方法及其含量测定方法作一综述，并作以比较分析。
关键词：穿山龙；薯蓣皂苷元；提取分离；含量测定
中图分类号：R284．2
文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)01-0164-02
2005年版《中华人民共和国药典》一部规定穿山龙为薯蓣科植物穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino的干燥根茎，其有效成分主要为甾体皂苷类，包括水不溶性皂苷[薯蓣皂苷(Diosgenin)、纤细皂苷(Gra~illin)]和水溶性皂苷，总皂苷酸水解产生均为薯蓣皂苷元(Diosgenin)。薯蓣皂苷元(diosgenln)是异螺甾烷的衍生物，化学名为3一20[3F,22aF,25aF螺旋甾烯3β醇，白色结晶性粉末，可溶于常用有机溶剂及醋酸中，能与洋地黄皂苷生成沉淀。由于甾体激素类药物的临床疗效独特，穿山龙中薯蓣皂苷元又是合成甾体激素的主要原料之一，因此人们逐渐开始重视穿山龙的资源开发，不断地探索薯蓣皂苷元的提取工艺以提高产率。本文对近年来穿山龙中薯蓣皂苷元提取工艺及含量测量方法的国外相关文献予以归纳总结，为改进提取工艺、制定产品的质量研究标准以及质量可控提供了有利的研究参考资料。
1 提取分离
1．1直接酸水解法 20世纪50年代末，我国采用Rothrok首创的直接酸水解法生产薯蓣皂素的工艺。由于直接酸水解法设备相对简单，研究得较为成熟，实际应用较普遍。即把原料浸泡粉碎加酸加热水解，然后用有机溶剂提取。其流程为：原料浸泡-酸水解-洗涤-甩滤-干燥-提取-结晶-成晶。丁惠玲等改进了薯蓣皂苷的水解方法，取穿山龙碎块50g加硫酸(9=8％)溶液浸泡24h后，于高压锅中加压水解(101.3～141．8kPa,120～126qc)2h，放凉后取出，过滤，其他步骤同常规酸水解法。通过实验的改进，由原来水解时间6h，缩短为2h，不仅节约用电，减少仪器的损坏，而且能正常的完成实验。从提取得到的产品薯蓣皂苷元的量可看出，收率提高将近1倍，降低了实验成本。但本法提取工艺操作繁琐，需要在高温高压下水解，能耗高，生产周期长，成本高，且提取物中杂质含量高，需要脱色、多次的重结晶工艺，纯化步骤多且难度大，收率低。
1．2水解原位萃取法 与直接酸水解法相比，水解原位萃取法无需高温高压条件，且工艺简单、省时、准确、实用性强。王俊等将穿山龙含约1．5rod・L-1硫酸的75％异丙醇水溶液在沸水浴中加热回流提取4．5h，提取后将滤液用石油醚(沸点60～90℃)在磁力搅拌下进行多次液一液萃取，每萃取0．5h后，换用新鲜溶剂，继续萃取，重复4次。该工艺薯蓣皂苷元得率高，成本低，操作简单，实用性好。但由于目前萃取工艺一般采用汽油、酒精、石油醚、己烷、氯仿、苯等有机溶剂为溶媒，能耗高，有易燃易爆的危险，且对环境造成了污染。
1．3超临界CO2(Sc―co2)萃取法超临界流体萃取系统具有较快的传质和萃取速度，是近年来新兴的萃取手段之一，具有无污染、效率高等特点，与有机溶剂法相比更经济、更安全，在实现工业化生产方面具很大的潜力。陈钧等对穿山龙中薯蓣皂苷元进行了Sc―CO2提取实验研究：将药材粉碎，60℃干燥8h后。置高压反应釜中，加压水解。水解完毕，将水解物取出，加饱和石灰水中和至pH=7，真空抽滤，滤渣用蒸馏水洗涤3次，80℃下干燥。将干燥物粉碎，在预先设定的萃取条件下浸泡6h，然后等温萃取，溶有薯蓣皂苷元sc―CO2经针阅节流后进入分离器中，实现薯蓣皂苷元的分离。萃取物每隔1h采样1次，直至萃取完全。
比较以上3种方法，实际应用最普遍的方法为直接酸水解法，但此法水解条件高、能耗高。提取物中杂质含量高，纯化步骤多且难度大，收率低。与之相比水解原位萃取法无以上弊端且工艺简单，省时、准确、实用性强。较水解原位萃取法，SC-CO2萃取技术能耗低，安全性好，无污染。收率高，可有效简化后续的提纯与再结晶工艺，是目前正被广泛研究并逐步在天然活性成分提取方面应用的新技术。
2 含量测定方法
薯蓣皂苷元的测定方法有重量法、比色法、薄层扫描法、高效液相色谱法以及气相色谱法等。具体测定方法如下。
2．1重量法 将新鲜穿山龙100g切成薄片，加等量水高速搅拌5min，加3．5mol/L盐酸溶液115mL回流水解3h。室温冷却后，用布氏漏斗过滤，残渣用永50mL洗8～lO次后干燥。将此干燥的残渣置沙氏提取器中石油醚(30～60℃)提取8h，将提取液浓缩至10mL，在室温放置2h，此时有薯蓣皂苷元的白色结晶析出，垂熔漏斗过滤，结晶用溶剂洗两次，在室温放置30min，105℃干燥30mln后称重，计算薯蓣皂苷元的含量。本法操作步骤繁杂，逐渐被新的测定方法所取代。
2．2比色法 穿山龙薯蓣皂苷元可与下列试剂显色：甲醛一硫酸、改良Licbemann试剂、硫酸、浓硫酸一甲醇、三氯化锑的硝基苯溶液、高氯酸、70％高氯酸一24％五氯化锑的70％高氯酸溶液以及茴香醛乙醇溶液一磷酸。可利用这些颜色反应进行比色进行比色测定。
2．3薄层扫描法 薄层扫描法较上述二法简便快速、灵敏准确、专属性好。因而广泛地应用于植物药学领域。
取穿山龙样品提取液点在硅胶G薄层板上，以羊毛甾醇为内标物，浓度为6．67μg/10uL，以己烷一丙酮(4：1)为展开剂，展开后在空气中干燥10min，然后喷饱和三氯化锑溶液，在100℃加热8min，40min后在470mm测定斑点面积。但此法测定结果不够理想。
2．4毛细管气相色谱法 毛细管气相色谱法对于组分多的混合物，既可分离，又能提供定量数据，较薄层扫描法精密度好。都述虎等采用HP-1(Methyhiloxanc)不锈钢毛细管柱，柱箱温度：270℃，柱头压：123．7kPa，汽化室温度：330℃，检测器温度：310℃，载气(N2)流速：2mL・min-12，分流比40：1对穿山龙薯蓣总皂苷中薯蓣皂苷元含量进行测定，样品无需衍生化处理，对照品峰与杂质峰没有重叠，分离效果好(分离度为11．21)，分析速度快(tR约为6．40min)，理论塔板数按薯蓣皂苷元计算为28756(n=3，RSD=1．6％)。但沸点高，气相条件要求苛刻。
2．5高效液相色谱法 HPLC法与气相色谱法相比，存在使用范围广，流动相选择性大，层析柱使用寿命长，流出组分易收集，样品净化预处理过程简单，可同时分离测定多种物质等优点。穿山龙中甾体皂苷元紫外吸收较弱，这给流动相的选择带来了一定的困难。已建立的高效液相色谱方法包括正相和反相色谱法，均采用末端吸收波长进行检测。杜庆鹏等U6J采用HPLC法测定穿山龙中薯蓣皂苷元的含量。色谱条件色谱柱：Shim-pack CLC-sil(150mm×6．Omm)，石油醚一异丙醇(98：2)为流动相，检测波长206nm，流速：1．2mL／min。分离效果好，样品无需衍生化，方法快速准确。早期的分析方法多采用正相色谱法，目前以反相色谱法应用最为广泛。都述虎以纯甲醇为流动相，在C18柱上测定了穿山龙薯蓣中薯蓣皂苷元的含量。徐雄良等用RP-H-PLC法测定穿龙薯蓣总皂苷中薯蓣皂苷元的含量。采用uBOndapak C18柱，甲醇为流动相，996二极管阵列检测器(DAD)，检测波长为208nm，该法能将薯蓣皂苷元与主要杂质分离开来，分离效果好，灵敏度高，重现性好，分析快速准确。不足之处是流动相对测定干扰较大。杜志茂用RP-HPLC法测定了由穿龙薯蓣有效成分精制而成的纯中药制剂一维奥欣片中的薯蓣苷元含量，为该药物鉴别及质量控制提供了科学依据。
综上所述。对穿山龙中薯蓣皂苷元的测定方法很多，但大多数制剂由于成分复杂，干扰严重，相比之下，高效液相色谱法因操作简单、快速、灵敏度高、重现性好而优于其他方法。
随着科学技术的发展、人们对穿山龙的研究更加深入，薯蓣皂苷元提取工艺及测定办法在不断改进和提高。目前的生产工艺还有待进一步改进，不仅要有高的提取率和好的产品质量，而且要考虑省时、省力、自动化程度高。用sc-CO2萃取法分离比常规方法提取率高，能保持产品的天然特性，而且环境污染小，因此就目前来看是大规模生产的最好方法。在测定方法中，高效液相色谱法因在操作方法、分离效果、分析速度、重现性方面有较强优势而被广泛应用。不难看出，尽可能多地采用新方法、新工艺、新技术，无疑会提高中药有效成分的提取分离水平和质量。本文对于穿山龙中薯蓣皂苷元的研究必将产生深远的意义和广阔的市场前景。