转录因子Nrf2在丹参乙酸镁调控血管平滑肌细胞内血红素加氧酶—1中的作用

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【摘 要】目的：探讨转录因子nrf2在丹参乙酸镁调控血管平滑肌细胞内血红素加氧酶-1（HO-1）的作用。方法：构建pRNAT-U6.1/Neo-siNrf2真核表达载体，并将其瞬时转染入大鼠主动脉平滑肌细胞内，瞬时转染后，用100 μmol/L丹参乙酸镁处理细胞，检测细胞内HO-1蛋白表达水平。结果：将Nrf2沉默后，丹参乙酸镁诱导HO-1蛋白表达的作用明显减弱。结论：转录因子Nrf2参与了丹参乙酸镁调控血管平滑肌细胞内HO-1的蛋白表达上调。

【关键词】丹参乙酸镁，血红素加氧酶-1，Nrf2

【中图分类号】R965.2 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）11—0046—02

氧化应激及其介导的脂质过氧化反应在心绞痛的发生发展中可能扮演重要角色[1]。目前防治冠心病的相当一部分抗氧化药物不具有调节氧化应激和增加机体抗氧化防御系统作用。丹参多酚酸盐广泛用于冠心病治疗[2]，其主要活性成分为丹参乙酸镁可通过上调体内HO-1[3]、超氧化物歧化酶等抗氧化酶的水平或活性而达到保护细胞的作用，但具体机制仍不清楚，因此本研究进一步探讨丹参乙酸镁调控细胞内HO-1具体机制。

1 材料与方法：

1.1 主要药品及仪器：

大鼠主动脉平滑肌细胞购自ATCC细胞库，pRNAT-U6.1/Neo Vector（美国Genescript公司），限制性内切酶BamHI，Hind III（博尚生物技术有限公司），DMEM液体培养基（美国Invitrogen公司），胎牛血清（杭州四季青公司），HO-1抗体（英国abcam公司），蛋白抽提试剂盒（碧云天生物工程有限公司），丹参乙酸镁由绿谷集团提供。

1.2 靶向Nrf2真核表达载体的构建与鉴定

从Nrf2基因mRNA序列中，按照shRNA序列的选取原则，选择一对靶向Nrf2寡核苷酸shRNA序列，结构如下Nrf2-F：5’-GATCCC19GAGTATGAGCTGGAAAAACTTGA

TATCCGGTTTTTCCAGCTCATACTCTTTTTTCCAAA-3’，Nrf2-R：5’-AGCTTTTGG

AAAAAAGAGTATGAGCTGGAAAAACCGGATATCAAGTTTTTCCAGCTCATACTCGG-3’将上述合成的互补单链与双链shRNA连接，得到重组质pRNATU6.1/Neo-siNrf2，转化感受态细胞DH5α后，将细胞涂布于LB固体培养基上平板倒置于37 ℃培养箱中过夜培养。每个平板分别挑取4个克隆在3 mL液体LB 培养基中，摇床上37 ℃， 230 r /min 培养14 h。取2μL 培养菌液做菌落PCR 鉴定，使用载体通用测序引物进行

PCR，引物序列分别为：5'-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3' ，5'-CTCTAGATCAA

CCACTTTGT-3'，阳性克隆PCR 产物约为338bp，进一步测序。测序结果进行同源性分析，测序结果与所设计序列完全同源的重组子为最终正确的重组质粒。

1.3 细胞的培养和转染

大鼠主动脉平滑肌细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中（含青链霉素）37 ℃、5%CO2条件下培养，选取3-5代细胞实验，待细胞密度达到50%时，按照脂质体LipofectamineTM2000说明书将siNrf2载体瞬时转染入平滑肌细胞48h后，用100μmol/L丹参乙酸镁处理24h，用Western blotting检测HO-1蛋白水平。

1.4统计学方法：运用SPSS13.0统计软件对数据进行处理，所有的数据均以均数±标准差表示，运用单因素方差分析，对各组进行描述性分析和方差齐性检验，采用SNK法分析各组间的差异，P

2 结果

2.1靶向Nrf2基因RNA干扰真核表达载体的鉴定

如图1，2所示，测序结果证实合成的69 bp寡核苷酸成功无突变地插入pRNAT-U6.1/Neo载体中，构建质粒符合要求。

3 讨论

生理状态下，机体为了维持正常的生理状态，必须形成一套防御机制免受过氧化损伤。Nrf2属于转录因子亮氨酸拉链转录激活因子家族成员之一，是诱导Ⅱ相酶基因表达的必需调节因子[4]。Ⅱ相酶中HO-1是机体最重要的内源性保护体系之一，可分催化血红素释放出铁、一氧化碳（CO） 和胆绿素，胆绿素在还原酶的作用下迅速转化为胆红素，后者是强有力的自由基清除剂。

丹参乙酸镁可提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、HO-1等多种抗氧化酶活力和水平，从而介导组织细胞的保护作用[5]，可促进氧化应激下Nrf2蛋白向细胞核内转位，本研究显示Nrf2沉默后，丹参乙酸镁诱导HO-1蛋白表达的作用明显减弱，表明转录因子Nrf2参与了丹参乙酸镁调控血管平滑肌细胞内HO-1的蛋白表达上调，为丹参多酚酸盐治疗冠心病进一步提供了理论支持。

参考文献：

[1] 张玉泉.麝香保心丸对冠心病不稳定型心绞痛患者氧化应激的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（10）：334-336.

[2] 齐婧，郭志华.丹参多酚酸盐注射液治疗不稳定型心绞痛35例疗效观察[J].湖南中医杂志，2013，29（5）：34-35.

[3] 任贤， 屈健 沈杰，等。丹参乙酸镁对人胚肾细胞内血红素加氧酶表达的影响[J].中国临床药理学与治疗学，2011，16（5）：481-487.

[4] 乔丽杰，王延让，张明.Nrf2 /HO-1通路在氧化损伤保护机制中研究进展[J].中国临床药理学与治疗学，2011，16（5）：82-84

[5] 廖舒坦，张希.丹参多酚酸盐对体外循环心瓣膜置换术心肌保护的作用[J]. 中国胸心血管外科临床杂志，2011， 18（ 3） ： 204.