KLF2、KLF4预测内毒素所致急性肺损伤大鼠的研究
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【摘要】目的 研究Krüppel样转录因子klf2、klf4在内毒素诱导大鼠急性肺损伤时的动态表达，分析两者与急性肺损伤的相关性。方法 将100只SD大鼠随机（随机数字法）分为健康对照组和模型组，模型组进一步随机分成3组。模型组采用尾静脉注射LPS（5 mg/kg）复制ALI模型，分别于尾静脉注射后2、4、24 h后采血及肺组织。观察各组病理表现、RT-PCR检测KLF2 mRNA、KLF4 mRNA在血清中及肺组织的表达，分析KLF2、KLF4在急性肺损伤中的动态表达，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。结果 病理显示造模后4 h肺损伤最为明显，KLF2 mRNA、KLF4 mRNA在正常大鼠肺组织及血清中均有明显表达，模型组各组KLF2、KLF4的表达较对照组显著减弱（P
【关键词】KLF2；KLF4；急性肺损伤；内毒素；早期诊断
Study the roles of KLF2， KLF4 in prediction of acute lung injury in rats induced by endotoxin Yang Yong， Shen Youkui， Dong Liwen， Lou Zhengqing， Wang Jun， Fu Xiaoqing. Department of Cardiothoracic Surgery， Guangxin Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310007，China
Corresponding author： Shen Youkui， Email：
【Abstract】Objective To investigate the expressions of KLF2 mRNA and KLF4 mRNA in the acute lung injury （ALI） rats induced by lipopolysaccharide （LPS）， and to analyze the correlation between KLF2， KLF4 and ALI.Methods A total of 100 SD rats were randomly divided into 2 groups： normal control group and LPS treated group， then the latter group was randomly further divided into 3 subgroups as per the serum and lung tissue samples taken separately at 2， 4 and 24h after modeling. The ALI model was made by injecting 5mg/kg LPS into tail vein .The pathological changes of lung tissue were observed in each group，and the expressions of KLF2 ，KLF4 mRNA in serum and lung tissue were detected by RT-PCR. The data of laboratory findings were analyzed with SPSS 17.0 software for statistical analysis. Results The histopathological changes showed the most obvious damage of lung tissue occurred at 4 hours after modeling. The expressions of KLF2 mRNA and KLF4 mRNA in the lung tissue and serum of control group were significantly higher compared to LPS treated subgroups （P
【Key words】KLF2；KLF4；Acute lung injury；Endotoxin ；Early diagnosis
急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是源于直接或间接的急性进行性肺泡毛细血管膜的炎症性损伤，临床表现为顽固性低氧血症、进行性加重的呼吸困难和非心源性肺水肿等，随着病情发展进一步转变为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），ARDS是临床中发病率和病死率都很高的一种疾病。目前临床上主要根据其病理生理改变和临床表现，采取综合性治疗措施[1-4]，但其发病率和病死率仍居高不下。因此预防和治疗此疾病在临床中具有重要的意义。KLF2，KLF4是锌指Krüppel样转录因子家族成员之一，近年来研究发现KLF2，KLF4在许多肺部疾病中呈现出不同的表达情况，在许多肺部疾病的发病中可能具有关键作用。本实验试图通过观察急性肺损伤大鼠血清及肺组织中KLF2，KLF4的动态表达，探讨其早期诊断急性肺损伤的可行性。
1 材料与方法
1.1 动物
健康成年SD大鼠100只，雌雄不拘，体质量（250±20） g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。
1.2 主要仪器与试剂
脂多糖（LPS， EscherichiacoliO127： B8， L3129， Sigma， 美国）； RM-80呼吸频率监测器（美国Columbus 公司），ABI7500实时荧光PCR仪（美国ABI公司），Total RNA Extraction Reagent（Trizol） 购自杭州硕盟生物，ReverTra Ace qPCR RT kit购自TOYOBO公司，Bestar-Real Time PCR Master Mix（SYBR Green染料法）购自德国DBI Bioscience公司。
1.3 实验分组
根据前期研究结合文献[5-6]报道，将100只SD大鼠随机（随机数字法）分为正常对照组（A组，n=10）和模型组（n=90），其中模型组被进一步随机分成三组：B组（造模2 h，最初阶段，ALI形成，n=30），C组（造模4 h、ALI高峰组，n=30），和D组（造模24 h，ALI减轻组，n=30）。
1.4 模型复制
采用尾静脉注射LPS复制ALI模型，剂量均为5 mg/kg。对照组尾静脉注射1 mL生理盐水。用2.5%戊巴比妥（2 mL/kg）在大鼠腹腔注射麻醉后开胸；心脏取血制备血清，分离后置于-80 ℃冰箱保存待检；取右肺上叶制作肺组织匀浆，-80 ℃冰箱保存待检；取右下叶肺组织马上备检，用于肺湿/干质量比测定；取左下叶肺组织以10%甲醛固定24 h，用于病理组织检查。
1.5 呼吸频率的测定
处死大鼠前用呼吸频率监测器测定大鼠的呼吸频率。
1.6 肺组织含水量测定
取右下叶肺组织，滤纸吸干表面水分，置于干燥称量纸上称得湿质量（W），置70 ℃恒温箱，烘烤至恒重后称量干质量（D），以湿重干质量（W/D）比值表示肺组织含水量。
1.7 肺脏组织学观察
取左下叶肺放入10%甲醛溶液固定，常规HE染色后光镜下观察。任选10个视野从五项指标进行肺损伤评分，累加各项评分取其平均值作为ALI的病理评分，见表1。
1.8 KLF 2 mRNA的表达测定
采用SYBR Green染料法相对定量PCR对肺组织及血清分别进行检测。选用3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参基因，采用Primer Express 2.0和Beacon designer软件进行荧光引物的设计，然后由浙江大学分子生物实验室负责合成，序列如表2。
1.9 统计学方法
实验结果均以均数±标准差（x±s）表示，以SPSS 17.0软件进行分析。多组间比较采用One-way ANOVA方差分析，组间差异采用LSD检验方法。以P
2 结果
2.1 一般情况变化
试验前各组动物在静息状态下呼吸平稳，频率为60次/min左右，实验组在注入脂多糖后逐渐出现呼吸急促、烦躁，2 h左右出现呼吸窘迫状，轻度发绀，呼吸频率增加，4 h后发绀明显，频率100次/min左右。24 h时大鼠无明显发绀，呼吸频率仍较快。统计显示B、C、D组较A组呼吸频率均明显增加，差异具有统计学意义（P
2.2 肺组织含水量改变
模型各组湿干比重较对照组均有明显增加，差异具有统计学意义（P
2.3 肺组织病理改变
健康对照组：肺组织结构清晰、肺泡壁薄且光滑，肺泡间隔均匀一致；B组：肺泡腔轻度变窄，部分肺泡壁增厚，肺充血，肺间质轻度水肿，小灶状炎细胞浸润；C组：肺泡腔变窄或消失，腔内可见炎细胞明显增多，肺泡壁明显增厚，肺充血，肺间质水肿，炎细胞弥漫性浸润。D组：肺泡腔变窄，腔内可见炎细胞浸润，肺泡壁增厚，肺充血，肺间质水肿，灶状炎细胞浸润，见图1。B、C、D组较A组病理学评分均明显增加，差异具有统计学意义（P
2.4 KLF2、KLF4 mRNA的表达
2.4.1 组织及血清中KLF2 mRNA结果 B、C 、D组组织及血清中KLF2 mRNA的表达水平明显低于对照组，差异具有统计学意义（P
2.4.2 组织及血清中KLF4 mRNA结果 B、C 、D组组织及血清中KLF4 mRNA的表达水平明显低于对照组，其中B，C组与A组比较差异具有统计学意义（P
3 讨论
急性肺损伤（ALI）的发生和发展涉及到多种病理生理过程，包括炎症反应、氧化应激和凋亡等。其中炎症反应与氧化应激被认为是ALI早期最主要病理生理机制[4，7]。研究发现ALI在细胞水平上表现为中性粒细胞（PMN）、肺巨噬细胞（AM）等炎性细胞的浸润与激活，及血管内皮细胞（EC）的损伤；在分子水平上则表现为肿瘤坏死因子（NF-κB）的活化及众多促炎因子、黏附分子及趋化因子等的过度表达，并伴有多种炎性介质的产生，炎性介质所形成的炎性级联反应导致肺组织广泛损伤。研究表明，ALI时PMN在肺内大量聚集激活，释放白介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等多种介质加重肺损伤[8]，从动物模型证实，如果去除肺内中性粒细胞的聚集，肺损伤程度会大大减轻[9-10]；AM的激活通常是肺部炎胜反应发生的导火索。激活的AM可致NF-κB的过度活化、肺IL-1和TNF-α等的合成和释放[11]；肺血管EC既是受损的主要靶细胞，更是活跃的炎性反应和效应细胞，IL-1和TNF-α等可激活血管EC，使其上调表达ICAM-1等黏附分子。黏附分子通过影响炎性介质、炎性细胞等向肺泡迁移即黏附于肺泡或血管EC的强度而调节ALI的进程。同时由巨噬细胞和中性粒细胞在急性炎症过程中的大量激活和呼吸爆发现象导致了大量的氧自由基的产生[12]，自由基可引起生物细胞膜、蛋白质和DNA等的直接和间接的损伤。
KLF2、KLF4为Krüppel样转录因子子家族中的成员，KLFs广泛参与细胞增殖、凋亡，以及胚胎发育等多个生命活动的调控[13-15]。最近的研究表明转录因子KLF2、KLF4在炎症反应、氧化应激等方面发挥着重要的作用。Das等[16]研究证实KLF2可抑制单核细胞的促炎症活性，在体外试验中发现在单核细胞中细胞因子活化和分化时KLF2的表达降低，而给予KLF2转染可抑制脂多糖介导的促炎因子、细胞因子、趋化因子的表达和减少噬菌作用。相反，给予siKLF2干扰则增加炎症基因的表达，显示了KLF2是单核细胞活化的一个负调节因子；而Fledderus等[17]研究发现KLF2可以抑制活化转录因子-2（ATF-2）的核内活性，从而抑制促炎症基因的表达，也表明KLF2具有重要的抗炎作用。Mahabeleshwar等[18]研究发现KLF2具有抑制NF-κB及低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达作用，从而抑制炎症及氧化应激对细胞的损害，是感染和内毒素损伤的一个关键性的调节因子。Feinberg等[19]发现KLF4在巨噬细胞的活化中具有重要的转录调控功能，能促进巨噬细胞的活化，提示KLF4可能是一个可以调节炎症反应的重要转录因子。周智君等[20]研究发现KLF4在内毒素血症小鼠和小鼠巨噬细胞RAW264.7株中能抑制炎症介质细胞因子白介素-1β（IL-1β）的表达，而IL-1β是LPS刺激下的炎症细胞分泌的早期炎症介质之一。因此KLF2、KLF4可能是内毒素所致急性肺损伤的关键调控因子。
本实验结果表明，与健康对照组相比，模型各组的呼吸频率、干湿比及病理学评分均有明显的增高；说明造模是成功的，并且各组在4 h达到高峰，随后逐渐下降，可以得出LPS所致ALI模型在4 h肺损伤最为明显。通过RT-PCR检测可以观察到，KLF2在肺组织和血液中的表达情况是一致的，在正常对照组KLF2呈高表达，而在模型各组表达均降低，并在2 h表达最低，可以得出KLF2的表达减弱早于ALI的形成。而KLF4在肺组织和血液中的表达情况亦是一致的，在正常对照组KLF4亦呈高表达，而在模型各组表达亦均降低，并在4 h表达最低，可以得出KLF4的表达减弱与ALI的形成具有同步性。因此结合文献报道，KLF2在大鼠急性肺损伤表达变化早于病理变化，KLF4具有同步性；KLF2、KLF4可作为早期诊断急性肺损伤的分子标志物。同时KLF2、KLF4在ALI调控网络中可能具有重要的转录调控作用，是氧化应激和炎症反应调节的关键因素及信号转导途径中重要的调控因子，通过抗氧化应激、抑制炎症等作用来抑制急性肺损伤的形成。
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