猪场蚊子中乙型脑炎病毒的RT-PCR检测

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摘要：收集湖北省与安徽省部分猪场的蚊子样本，用ＲＴ－ＰＣＲ检测蚊子样本是否携带有乙型脑炎病毒，并对猪群乙型脑炎病毒抗体进行了检测。结果表明，５３份蚊子样品中乙型脑炎病毒阳性样品为４４份，表明这些猪场的蚊子广泛携带有乙型脑炎病毒。从阳性ＰＣＲ产物中随机选出８个，并将其克隆到ｐＥＡＳＹ－Ｔ１载体中，得到５个阳性重组质粒，进行序列测定和进化树分析，结果表明阳性蚊子样本携带的都是基因Ⅲ型乙型脑炎病毒。猪场的1 401份血清样品的乙型脑炎病毒抗体阳性率为57.7%，说明这些猪场猪群的乙型脑炎病毒感染率较高。

关键词：猪场；蚊子；乙型脑炎病毒；ＲＴ－ＰＣＲ

中图分类号：Ｓ８５２．６５＋９．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）14－3104-03

Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｉｇ Ｆａｒｍｓ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ

ＷＥＩ Ｙａｎ－ｍｉｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｉｇ ｆａｒｍｓ ｉｎ Ｈｕｂｅｉ ａｎｄ Ａｎｈｕｉ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＪＥＶ） ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ４４ ｏｕｔ ｏｆ ５３ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ， ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ＪＥＶ ｗａｓ ｗｉｄｅｌｙ ｃａｒｒｉｅｄ ｂｙ ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｐｉｇ ｆａｒｍｓ． ８ ｏｆ ｔｈｅ ４４ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＡＳＹ－Ｔ１ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ； ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ⅲ ＪＥＶ． The positive rate of JEV in 1 401 serum samples in the pig farms was 57.7%， indicating a high infection rate of JEV in these farms.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｉｇ ｆａｒｍｓ； ｍｏｓｑｕｉｔｏ； Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ； ＲＴ－ＰＣＲ

乙型脑炎病毒（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＥＶ）属于黄病毒科黄病毒属，是一种危害严重的共患虫媒性传染病病原。该病毒具有很强的神经毒力，感染人后可以引起乙型脑炎。据估计，乙型脑炎全球每年平均发病５万例，死亡１．５万人，５７％～６８％的治愈者留有神经学后遗症［１］，其中严重者占１８％，约５０％病人有记忆缺损，３／４病人有运动失调和智力机能受损［２，３］。近年来，随着人类活动及全球气候的变化，乙型脑炎的流行在世界范围内呈上升趋势。同时，乙型脑炎也是危害中国养猪业的重大疫病之一。

猪是乙型脑炎病毒的重要储存宿主和扩增宿主，也是乙型脑炎的主要传染源［４］。一般情况下乙型脑炎病毒的感染呈猪—蚊—人链状［５］。因此，通过监测湖北省与安徽省部分猪场蚊子中乙型脑炎病毒的流行与分布情况，为猪场乙型脑炎临床防控提供参考。

１ 材料与方法

１．１ 材料

１．１．１ 蚊子样品 蚊子样品于２００９年６月至８月采自湖北省和安徽省部分猪场。

１．１．２ 菌种与试剂 菌株Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α、ｐＥＡＳＹ－Ｔ１载体购自北京全式金生物技术有限公司、所用限制性内切酶、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、相应的缓冲液、ＤＮＡ分子质量标准ＤＬ ５ ０００购自宝生物工程（大连）有限公司；ＤＮＡ纯化回收试剂盒Ｃｙｃｌｅ－Ｐｕｒｅ Ｋｉｔ、质粒小提试剂盒Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ ＫｉｔⅠ购自美国Ｏｍｅｇａ生物技术公司，反转录试剂盒ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ α ＴＭ购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，乙型脑炎乳胶凝集抗体检测试剂盒购自武汉科前动物生物制品有限责任公司。

１．１．３ 引物 根据乙型脑炎病毒Ｅ蛋白基因序列设计并合成ＲＴ－ＰＣＲ所用的引物：Ｐ１：５′－ＧＣＴ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＧＣ ＡＣＡ ＡＣＣ－３′；Ｐ２；５′－ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＣＡ ＴＣＡ ＣＣＡ ＡＡＣ－３′。扩增的靶序列为４６７ ｂｐ。

１．２ 方法

１．２．１ 样品总ＲＮＡ的提取 将采集的猪场蚊虫样本用匀浆器研磨，制成悬液，反复冻融３次，以

３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，取２００ μＬ上清匀浆液，加入８００ μＬ的Ｔｒｉｚｏｌ细胞裂解液，振摇混匀，于室温放置１０ ｍｉｎ；加入２００ μＬ氯仿，混合均匀，于室温放置１０ ｍｉｎ后，以１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ；将上层溶液转入新的离心管中，加入等体积的异丙醇，于室温放置１０ ｍｉｎ，以１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ；弃去上清液，加入１ ｍＬ体积分数为７５％的乙醇，洗涤沉淀，以８ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ；弃去上清，于室温干燥５～１０ ｍｉｎ；加入２０～３０ μＬ ＤＥＰＣ水，溶解ＲＮＡ，直接用于反转录或保存于－８０ ℃冰箱备用。

１．２．２ Ｅ蛋白基因的ＲＴ－ＰＣＲ扩增 ２０.0 μＬ的反转录反应体系如下：总ＲＮＡ模板１０.0 μＬ，５×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ ４.0 μＬ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ２.0 μＬ，Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ０．５μＬ，ＡＣＥ－α ０．５ μＬ，Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５ μＬ，灭菌水２．５ μＬ。反应条件：３０ ℃反应１０ ｍｉｎ，４２ ℃反应３０ ｍｉｎ，９９ ℃反应５ ｍｉｎ。所得的ｃＤＮＡ保存于－８０ ℃冰箱备用。