糖尿病心肌病与早期扩张性心肌病心肌线粒体通透性转运孔开放的对比观察

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【摘 要】 目的：观察糖尿病心肌病与早期扩张性心肌病心肌线粒体通透性转运孔开放程度异同。方法：30只Wistar大鼠随机分成对照组、糖尿病组及扩心病组。造模成功，提取心肌线粒体，检测线粒体PTP开放、膜电位及Ca2+转运。结果：MPTP开放检测吸光值糖尿病组最高，与对照组及扩心病组比较均有显著性差异，扩心病组与对照组比较，有显著性差异；Ca2+转运检测吸光值及膜电位Rh123荧光值糖尿病组与对照组比较，有显著性差异，扩心病组与对照组比较，有显著性差异。结论：糖尿病心肌病与早期扩张性心肌病线粒体MPTP呈高开放状态，前者显著高于后者，MPTP呈高开放状态可能是糖尿病心肌病与早期扩张性心肌病在线粒体能量代谢方面共同病理生理机制。

【关键词】 糖尿病心肌病；扩张性心肌病；线粒体通透性转运孔

Diabetic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy early myocardial mitochondrial

permeability transition pore opening Comparative study

【Abstract】Objective：Observation of early diabetic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy myocardial mitochondrial permeability transition pore similarities and differences between the degree of openness。Methods：30 Wistar rats were randomly divided into control group, diabetes, expanding heart disease group ，Diabetic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy early modeling success, Detected mitochondrial PTP opening and membrane potential and Ca2 + transport。Results：MPTP opening detect the highest absorbance value of the diabetic group compared with the control group and extend heart disease group were significantly different, expanding heart disease group and control group, there is a significant difference ；Detection of Ca2 + transport absorbance and Membrane potential, Rh123 fluorescence diabetic group and control group, there is a significant difference, expanding heart disease group and control group, there is a significant difference。Conclusion Diabetic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy early mitochondrial MPTP showed a high open state, the former was significantly higher than the latter。Diabetic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy early in the mitochondrial energy metabolism that is a common pathophysiologic mechanism。

【Key words】Diabetic cardiomyopathy; dilated cardiomyopathy; MPTP

线粒体膜通透转运孔(mitochon-drialpermeability transition pore, MPTP)是线粒体内外信息交流的中心枢纽,其开放状态决定着线粒体功能的发挥。本研究旨在观察MPTP在糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DC)及扩张性心肌病实验大鼠中(dilated cardiomyopathy,DCM)开放高低的差异，以探讨MPTP在两者病理生理机制中作用的异同。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1动物清洁级雄性Wistar大鼠40只,体重180~200g,由华中科技大学实验动物中心提供(合格证001号,环境设施合格证028号)。随机分为对照组、糖尿病心肌病组（糖尿病组）、扩张性心肌病组（扩心病组），每组10只。

1.1.2试剂链脲佐菌素(Sigma公司,批号S01301178);吠喃哇酮(成都前江制药厂，国药准字H51020009)，梭甲基纤维素钠(Sigma公司)。HEPES，牛血清蛋白，罗丹明123（Rh123），偶氮砷（钙离子指示剂AⅢ，Sigma公司）；Bradford试剂盒（上海朝瑞生物有限公司）；其他为国产分析纯。

2 方法

2.1糖尿病心肌病大鼠模型的建立大鼠喂养1周后,随机取大鼠10只,参考文献方法[1]建立糖尿病心肌病大鼠模型。

2.2 扩张性心肌病大鼠模型的建立大鼠喂养1周后,随机取大鼠10只,参考文献方法[2]建立扩张性心肌病大鼠模型。

2.3 线粒体的提取

所有大鼠造模成功后，迅速取出心肌，剪碎置于10倍线粒体分离介质中［225mmol/L甘露醇、75mmol/L蔗糖和20mmol/L Hepes，0.5mmol/L EGTA和1%牛血清白蛋白（pH7.2）］，冰水浴中匀浆。匀浆液于4℃离心10分钟，除去细胞碎片及细胞核，取上清离心10分钟，所得沉淀即为线粒体。线粒体蛋白含量用Bradford检测试剂盒检测，得到的线粒体按12mg/ml蛋白浓度用PTP测试介质悬浮并置冰上保存。使用前用PTP测试介质稀释至0.3mg/ml蛋白浓度。

2.4 PTP开放检测：参照文献[3]的方法。

2.5 线粒体膜电位检测：参照文献[3]的方法。

2. 6 线粒体Ca2+转运检测：参照文献[3]的方法。

2.7 统计学处理

所得数据以SPSS 13. 0统计软件进行t检验,以P

3 结果

由表1可见，MPTP开放检测吸光值糖尿病组最高，与对照组及扩心病组比较均有显著性差异（P

表1 两组大鼠线粒体MPTP开放、Ca2+转运

及膜电位RH123测定值比较

组别 例数 线粒体MPTP

开放 Ca2+转运 膜电位RH123

对照组 10 0.051±0.019 0.050±0.014 0.044±0.026

糖尿病组 10 0.096±0.022 0.066±0.015 0.054±0.024

扩心病组 10 0.064±0.023 0.055±0.016 0.049±0.021

4 讨论

线粒体通透性转变孔道位于线粒体内外膜结合处，此蛋白孔道的开放能引起膜电位的下降或消失、对细胞的凋亡起重要的调控作用。而Ca2+转运是线粒体调控胞内生理和病理过程中的重要事件之一，特别是在缺氧应激过程中起重要的作用。在受到特定刺激时,MPTP高水平开放,造成离子和一些活性物质(如细胞色素C)释放,线粒体内外电荷分布紊乱,线粒体膜除极,最后膜电位降低或丧失。因此,可以通过检测膜电位及Ca2+转运来观察MPTP的变化。

本研究结果显示，糖尿病组线粒体MPTP呈高水平开放，与正常对照组有显著性差异，高通透性的线粒体MPTP的开放使得线粒体释放细胞色素C及细胞凋亡诱导因子等，Waczulikova等[4]认为高糖诱导糖尿病心肌病MPTP开放的增加，通过攻击线粒体及增加线粒体膜的通透性,促进细胞色素C释放入细胞质中,与凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease activating factor-1, Apaf-1)结合,并激活Caspase家族蛋白酶从而介导细胞凋亡，而凋亡的持续存在是心肌纤维化不断发展的推动力，致心肌结构和功能改变，从而引起糖尿病左室舒张和/或收缩功能障碍。结果中，糖尿病组膜电位明显降低，与对照组存在显著性差异。糖尿病Ca2+转运较对照组高，也有显著性差异。通过测定这两个指标，进一步证实了糖尿病组大鼠心肌MPTP开放的增加，可能是糖尿病心肌病发病机制之一。

另外，我们研究结果还显示，早期扩张性心肌病大鼠MPTP开放与对照组比较，也呈增加状态。膜电位测定值明显下降，Ca2+转运测定值升高，与对照组比较，均有显著性差异。证实扩张性心肌病其病理生理机制与线粒体能量代谢相关，线粒体MPTP高开放可能导致氧化磷酸化障碍可引起线粒体的功能异常，进而引起心脏能量代谢障碍，直至心脏扩张，舒张和收缩功能受损。因此我们可能证实了心肌线粒体MPTP高开放是糖尿病心肌病与扩张性心肌病共同的发病基础。与糖尿病组比较，MPTP开放有显著性差异，且糖尿病组MPTP高开放状态更显著。说明糖尿病组较早期扩张性心肌病线粒体内膜功能受损更明显，心肌缺血、缺氧更严重，心室重构更明显。

总之，本研究对糖尿病心肌病及早期扩张性心肌病的线粒体MPTP开放作出了初步的探讨，对我们临床诊疗疾病提供了一定的理论基础。但两者具体信号调控通路有待我们进一步深入研究。

参考文献

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[3] 胡志刚，周蕾，丁树哲。联合补充乙酰左旋肉碱和 硫辛酸对耐力训练大鼠骨骼肌线粒体通透性转运孔开放的影响[J]。中国运动医学杂志，2009，28（9）：564-566。

[4] aczulikovaI,HabodaszovaD,CagalinecM,etal.Mitochondri-almembrane fluidity, potential, and calcium transients in the myocardium from acute diabetic rats[J]. Can J PhysiolPharma-co,l 2007, 85(3-4): 372-381.