金纳米粒子比色探针检测牛奶及鸡蛋中的三聚氰胺

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摘 要 三聚氰胺能诱导金纳米粒子（AuNPs）团聚，溶液颜色由酒红色变为紫色或蓝灰色。以AuNPs作为比色探针，建立了快速检测牛奶和鸡蛋中三聚氰胺的方法。实验优化得最佳反应条件为： AuNPs粒径 13 min、pH＝7、反应时间10 min和温度为室温。对样品中常见物质进行了干扰实验。样品经10%三氯乙酸和氯仿提取、离心分离后可直接测定，本方法对牛奶和鸡蛋中三聚氰胺的检出限分别为0.1和2.5 mg/L（S/N＝3），加标回收率分别为95.0%～105.0%和98.0%～104.0%。

关键词 三聚氰胺；金纳米粒子；比色；牛奶；鸡蛋

2011-08-02收稿；2011-10-05接受

本文系国家自然科学基金（No.20905031）、吉林大学引进优秀人才科研基金（No.430505010206H6）资助项目

* E-mail：zhangth@jlu.省略

1 引 言

三聚氰胺（C3H3N6）是一种重要的氮杂环有机化工原料，其含氮量高达66%，常被人为添加到牛奶、奶粉以及动物饲料中以虚增蛋白质含量。三聚氰胺不是食品添加剂，它不能在体内代谢，过多的摄入会引起肾结石[1]。因此，严禁在奶制品和其它食品中使用三聚氰胺。我国政府规定， 三聚氰胺在婴幼儿奶粉和其它食品中的最大允许残留量分别为1.0和2.5 mg/kg。目前，检测三聚氰胺的方法主要有高效液相色谱法[2，3]、气相色谱串联质谱法[4，5]、液相色谱串联质谱法[6，7]等。

金纳米粒子（AuNPs）以独特的光学和电学性质被广泛应用于传感器[8，9]。AuNPs具有良好的生物相容性和稳定性，消光系数高，易合成。以AuNPs为探针的比色传感器被广泛用于检测核酸[10]、蛋白质[11]、病毒[12]、金属离子[13]等。本研究采用Frens方法合成了柠檬酸根保护的AuNPs。在通常情况下，AuNPs呈分散状态，三聚氰胺能够诱导AuNPs团聚，颜色由酒红色变为紫色或蓝灰色。据此，本研究建立了AuNPs比色法快速检测三聚氰胺的方法。与文献中采用氰尿酸衍生物[14]或冠醚[15]等修饰的AuNPs为比色探针的方法相比，本方法灵敏度相对较低，但不需要繁琐的有机合成或修饰过程，避免了引入其它物质造成的偏差。本方法与液相色谱法[2，3]、液（气）相色谱串联质谱法[4～7]比较，灵敏度较低，但样品前处理简单，不需要衍生，整个检测过程只需要30 min，成本低，有望用于实际样品的现场快速检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

PHS-3C pH计（上海康仪仪器公司）；UV-2550紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；TECNAI F20透射电镜（荷兰FEI公司）；CR20B2冷冻离心机（日本Hitachi公司）。

三聚氰胺（优级纯）；乳糖、葡萄糖、氯金酸、柠檬酸钠等（分析纯）；氨基酸、肽类（酶解蛋清蛋白，主要为氨基酸和20个以内氨基酸的肽链）。牛奶样品（原料奶）、鸡蛋样品（有机食品）购于本地超市。

2.2 实验方法

2.2.1 金纳米粒子的合成 根据文献[16，17],合成粒径为13和20 nm的AuNPs。将AuNPs滴于镀有碳膜的铜网上，室温晾干后，用透射电镜（TEM）观察其尺寸和形貌。仪器工作电压为200 kV。

2.2.2 检测方法的建立 在2 mL离心管内，将450

SymbolmA@ L AuNPs溶液调至pH 7.0，并稀释至1.45 mL，加入0.45 mL不同浓度的三聚氰胺标准溶液，摇匀，室温反应10 min。以三聚氰胺的浓度为横坐标，以

SymbolDA@ A525（加入三聚氰胺前后，AuNPs在525 nm的吸光度的差值）为纵坐标，绘制工作曲线。

2.2.3 样品前处理 分别取4 mL纯牛奶或蛋清溶液（蛋清与水以体积比为2:1）（鸡蛋中99.8％三聚氰胺在蛋清中[18]），分别加入1.2或1.5 mL 10％三氯乙酸、1.5或2 mL氯仿，涡旋振荡1 min，超声15 min后，混合物以13000 r/min离心10 min。取上清液过滤，用1 mol/L Na2CO3调至pH 8.0，再以3000 r/min离心3 min，取上清液，待用。

3 结果与讨论

3.1 AuNPs比色法检测三聚氰胺

AuNPs溶液呈酒红色（图1A，插图1），吸收光谱如图1A中绿线，吸收峰在525 nm，特征吸收峰较尖锐，表明AuNPs的粒径分布较均匀。采用TEM观察AuNPs（图1B），AuNPs呈规则的球形，并且粒径均一（约为13 nm）， 分散较好。向AuNPs溶液中加入三聚氰胺后，溶液的颜色变成紫色（图1A，插图2），525 nm处的吸收强度降低，且在680 nm处出现新的吸收带（图1A，蓝线）。图1C证实了三聚氰胺能够引起AuNPs发生聚集。采用三聚氰酸代替三聚氰胺进行控制实验，三聚氰酸不能引起AuNPs的团聚，AuNPs的吸收光谱不变（图1A，红线）。三聚氰酸与三聚氰胺的结构差异，表明，三聚氰胺诱导AuNPs团聚的主要因素为氨基基团。原因可能为，制备的AuNPs由带负电荷的柠檬酸根保护，

图1 （A） 吸收光谱图, AuNPs（绿线）；AuNPs与三聚氰胺溶液（蓝线）；AuNPs与三聚氰酸溶液（红线）。插图：照片; （B） AuNPs的透射电镜图；（C） AuNPs与三聚氰胺溶液混合体系透射电镜图。

Fig．1 （A） Absorption spectra of AuNPs in the presence of water （green line）, melamine （blue line） and cyanuric acid （red line）. （B） TEM image of AuNPs; （C） TEM image of AuNPs in the presence of melamine

静电斥力与范德华引力相抵消，所以AuNPs分散均匀。三聚氰胺有3个氨基，氨基可以取代AuNPs表面的柠檬酸根，结合在AuNPs表面，降低了AuNPs之间的静电斥力[19]，使AuNPs发生团聚；此外，覆盖在AuNPs表面的三聚

图2 AuNPs比色法快速检测三聚氰胺的原理示意图

Fig．2 Schematic illustration of rapid detection of melamine using AuNPs as colorimetric probe

氰胺通过间氢键作用（氨基之间，氨基与环上的氮原子）相互交联，也可使AuNPs发生团聚[13]（图2），从而引起AuNPs溶液颜色和吸收光谱发生变化。

3.2 实验条件的优化

3.2.1 AuNPs的粒径对体系的影响 合成粒径为13和20 nm的AuNPs，以吸收峰的差值为检测信号，发现13 nm的AuNPs对三聚氰胺的响应更加灵敏。原因可能是随着粒径的减小，AuNPs的表面能不断增加[20]，AuNPs与三聚氰胺的结合能力不断增强。

3.2.2 pH值对体系的影响

以乙酸缓冲溶液作介质，用1 mol/L的HCl或NaOH调节AuNPs的pH值，加入4 mg/L三聚氰胺，室温下反应10 min，

SymbolDA@ A525与pH值的关系如图3所示。当pH＝7.0时，

SymbolDA@ A525最大，原因是在强酸或者强碱的条件下，三聚氰胺会逐步失去3个氨基，转变为三聚氰酸[13]，三聚氰酸不能诱导AuNPs团聚。pH＝7.0时，AuNPs溶液在525 nm处吸收值最大。本研究中采用pH＝7.0的AuNPs进行实验。

3.2.3 反应时间对体系的影响 将450

SymbolmA@ L 1 mg/L三聚氰胺溶液与1450

SymbolmA@ L AuNPs混合，每隔2 min扫描吸收光谱，

SymbolDA@ A525与反应时间的关系如图4所示。当反应时间达到10 min时，溶液颜色不再变化，

SymbolDA@ A525趋于平稳，三聚氰胺诱导AuNPs团聚达到饱和。因此，选择反应时间为10 min。

图3 pH值对体系

SymbolDA@ A525的影响

Fig．3 Effect of different pH values of AuNPs on

SymbolDA@ A525

SymbolDA@ A525的影响

Fig．4 Variation curve of

SymbolDA@ A525 with different reaction time

3.2.4 温度对体系的影响 将450

SymbolmA@ L 1 mg/L三聚氰胺溶液与1450

SymbolmA@ L AuNPs混合，分别在10， 20， 30， 40， 50和60 ℃下反应10 min。结果表明，10 ℃时溶液颜色几乎不发生变化，反应进行缓慢；而温度在20～60 ℃时，溶液颜色的变化基本一致。温度较高时，AuNPs可能发生自团聚，本实验选择在室温下进行。

3.3 标准曲线的建立

将不同浓度的三聚氰胺标准溶液加入AuNPs溶液中，按2.2.2节的方法进行实验。随着三聚氰胺浓度的增大，AuNPs在525 nm处的吸收强度逐渐降低，在长波方向出现新的吸收带，其强度逐渐增强（图5）。 图5 不同浓度三聚氰胺存在时AuNPs的吸收光谱，三聚氰胺的浓度（箭头方向）依次为0， 0.1， 0.5， 2.0， 3.0和4.0 mg/L， 插图为三聚氰胺的标准曲线。

Fig．5 Absorption spectra of AuNPs in the presence of different concentrations of melamine. The concentrations of melamine （in arrowhead direction） are 0, 0.1, 0.5, 2.0, 3.0, 4.0 mg/L, respectively. The inset is the calibration plot of

SymbolDA@ A525 versus melamine concentration.当三聚氰胺的浓度在0.10～4.0 mg/L范围内时，

SymbolDA@ A525与三聚氰胺的浓度呈良好的线性关系（r＝0.99），方法的检出限为0.01 mg/L（S/N＝3）。

3.4 干扰实验

为了将本方法用于实际样品的检测，考察了食品中可能出现的物质对AuNPs稳定性的影响。实验中三聚氰胺的浓度为4 mg/L，氨基酸和肽类浓度为1.2 g/L，其它物质浓度均为200

SymbolmA@ mol/L。实验结果如图6所示，干扰物质不能引起AuNPs团聚。同时，实验了相同浓度的干扰物质对三聚氰胺诱导AuNPs团聚的影响。结果表明，这些物质的存在不会干扰AuNPs比色法检测三聚氰胺。

3.5 实际样品检测

在牛奶和鸡蛋样品中加入不同浓度的三聚氰胺，按照2.2.3节进行样品前处理。准确吸取450

SymbolmA@ L样品提取液，加入到1450

SymbolmA@ L AuNPs中，光谱分析结果如图7所示。当牛奶中三聚氰胺的浓度在2～40 mg/L范围内时，

SymbolDA@ A525与三聚氰胺的浓度呈良好的线性关系（r＝0.99，图7A插图），方法的检出限为0.1 mg/L（S/N＝3）。当鸡蛋中三聚氰胺的浓度在5～50 mg/L范围内时，

SymbolDA@ A525与三聚氰胺的浓度呈现良好的线性关系（r＝0.99，图7B插图），方法的检出限为2.5 mg/L（S/N＝3）。当牛奶中三聚氰胺的含量高于8 mg/L，鸡蛋中三聚氰胺的含量高于10 mg/L时，不需要借助仪器，通过肉眼即可观察到颜色变化。比较图7和图5，在牛奶、鸡蛋提取液和水中，三聚氰胺诱导AuNPs的吸收光谱变化略有不同。

图6 不同物质存在时AuNPs的吸收光谱 （A）和体系的

SymbolDA@ A525值 （B）

Fig．6 （A） Absorption spectra of AuNPs in the presence of different analytes. （B）

SymbolDA@ A525 of Au NPs solution in the presence of different analytes

1. 三聚氰胺；2. NaCl; 3. CaCl2; 4. （NH4）2SO4; 5. KNO3; 6. Vc; 7. 葡萄糖； 8. 乳糖； 9. 氨基酸及肽类。

1. Melamine; 2. NaCl; 3. CaCl2; 4. （NH4）2SO4; 5. KNO3; 6. Vitamin C; 7. Glucose; 8. Lactose; 9. Amino acid and peptides.

图7 牛奶（A）和鸡蛋（B）中加入不同浓度三聚氰胺时体系的吸收光谱。插图为相应的校准曲线

Fig．7 Absorption spectra of Au NPs with different concentrations of melamine spiked in milk （A） and eggs （B）

牛奶中三聚氰胺的浓度依次为0， 2， 10， 20， 30和40 mg/L。鸡蛋中三聚氰胺的浓度依次为0， 5， 10， 20， 30和50 mg/L（从上至下）

The insets the corresponding calibration plots of

SymbolDA@ A525 versus spiked melamine concentration. The concentrations of melamine in milk are 0， 2, 10, 20, 30, 40 mg/L. The concentrations of melamine in eggs are 0, 5, 10, 20, 30, 50 mg/L （up to down）.这可能是由于样品提取液中存在的少量氨基酸导致的[21]。在牛奶和鸡蛋中加入不同浓度的三聚氰胺，测其回收率，结果如表1所示，回收率分别为95.0％～105.0％和98.0%～104.0％。本方法操作简便、分析时间短、不需要精密复杂的仪器设备、检测成本低，适用于食品中三聚氰胺的现场快速检测。

表1 标准加入法检测牛奶， 鸡蛋中的三聚氰胺

Table 1 Determination of melamine in milk and egg samples spiked with different amounts of melamine by this method

样品

Sample编号No.加入量Added（mg/L）测得量Found（mg/L）回收率Recovery（%）RSD（%，

n＝3）样品

Sample编号No.加入量Added（mg/L）测得量Found（mg/L）回收率Recovery（%）RSD（%，

n＝3）

牛奶

Milk187.6952.6

21515.81053.133030.51024.4鸡蛋1109.8982.622020.11013.233031.21044.7

References

1 Brown C A, Jeong K S , Poppenga R H, Puschner B, Miller D M, Ellis A E, Kang Kyung-Il, Sum S, Cistola A M, Brown S A. J. Vet. Diagn. Invest.，2007, 19（5）: 525～531

2 Sun Ha W, Wang L X, Ai L F, Liang S X, Wu H. Food Control.， 2010, 21（5）: 686～691

3 WANG Hao, LIU Yan-Qin, CAO Hong, YANG Hong-Mei, LIU Xiao-Li, YAN Long-Bao. Chinese J. Anal Chem. , 2008, 36（2）: 273

王 浩， 刘艳琴， 曹 红， 杨红梅， 刘小力， 闫龙宝. 分析化学, 2008, 36（2）: 273

4 Li J, Qi H Y, Shi Y P. J. Chromatogr. A， 2009, 1216（19）: 5467～5471

5 LU Ye-Ju, SHU Yong, ZHAO Cheng-Shi． Chinese Journal of Chromatography, 2008, 26（6）: 749～751

卢业举, 舒 勇, 赵成仕. 色谱, 2008, 6（26）: 749～751

6 Xu X M, Ren Y P, Zhu Y, Cai C X, Han J L, Huang B F, Zhu Y. Anal. Chim. Acta，2009, 650（1）: 39～43

7 Kim B, Perkins L B, Bushway R J, Nesbit S, Fan, T T, Sheridain R, Greene V. J. AOAC Int.， 2008, 91（2）: 408～413

8 Asefa T, Duncan C T, Sharma K K. Analyst.， 2009, 134（10）: 1980～1990

9 MA Li-Na, LIU Dian-Jun， WANG Zhen-Xin. Chinese J. Anal. Chem., 2010, 38（1）: 1～7

马立娜, 刘殿骏, 王振新. 分析化学, 2010, 38（1）: 1～7

10 Cho M, Han M S, Ban C G． Chem. Commun.，2008, （38）: 4573～4575

11 Laromaine A, Koh L L, Murugesan M, Ulijn R V, Stevens M M. J. Am. Chem. Soc.， 2007, 129（14）: 4156～4157

12 Niikura K, Nagakawa K, Ohtake N, Suzuki T, Matsuo Y, Sawa H F, Ijiro K. Bioconjugate. Chem.， 2009, 20（10）: 1848～1852

13 Li L, Li B X, Qi Y Y, Jin Y. Anal. Bioanal. Chem.， 2009, 393（8）: 2051～2057

14 Ai K L, Liu Y L, Lu L H. J. Am. Chem. Soc.， 2009, 131（27）: 9496～9497

15 Kuang H, Chen W, Yan W J, Xu L G, Zhu Y Y, Liu L Q, Chu H Q, Peng C F, Wang L B, Kotov N A, Xu C L. Biosensors and Bioelectronics.， 2011, 26（5）: 2032～2037

16 SUN Li-Ping, ZHANG Jian-Feng, LI Hui, WANG Xiu-Yan, ZHANG Zhao-Wu, WANG Shuang, ZHANG Qi-Qing. Chem. J. Chinese Universities, 2009, 30（1）: 95～99

孙莉萍, 张建锋, 李 辉, 王秀燕, 张召武, 王 霜, 张其清. 高等学校化学学报, 2009, 30（1）: 95～99

17 SUN Xiu-Lan, ZHANG Yin-Zhi, SHAO Jing-Dong, ZENG Jie． Chem. J. Chinese Universities. ， 2007, 28（1）: 1449～1453

孙秀兰, 张银志, 邵景东, 曾 杰. 高等学校化学学报, 2007, 28（1）: 1449～1453

18 YANG Shui-Ping, CHEN Huan-Wen, YANG Yu-Ling, HU Bin, ZHANG Xie, ZHOU Yu-Fen, ZHANG Li-Li, GU Hai-Wei. Chinese J. Anal． Chem. , 2009, 37（3）: 315～318

杨水平, 陈焕文, 杨宇玲, 胡 斌, 张 燮, 周瑜芬, 张丽丽, 顾海巍. 分析化学, 2009, 37（3）: 315～318

19 Fang J H, Huang Y X, Li X. Raman Spectrosc.， 2004, 35（１１）: 914～920

21 Jiang Z L, Fang Z W, Li Y T, Li F, Zhong F X, Xie J Y, Yi X H. Science in China Series B-Chemistry.， 2001, 44（2）: 175～181

20 Zhong Z Y, Patskovskyy S, Bouvrette P, Luong J H T, Gedanken A. J. Phys. Chem. B， 2004, 108（１３）: 4046～4052

Gold Nanoparticles-based Colorimetric Sensing

of Melamine in Milk and Eggs

SUN Chun-Yan, ZHANG Min-Wei, LI Hong-Kun, Li Yan-Song, PING Hong, GUO Jia-Jia, ZHANG Tie-Hua.*

（College of Quartermaster Technology, Jilin University, Changchun 130062， China）

Abstract Melamine could rapidly induce the aggregation of gold nanoparticles （AuNPs）, thereby resulting in red-to-purple （even blue） color change. Thus, a rapid detection method for melamine in milk and eggs using AuNPs as colorimetric probe has been established. The experimental conditions was optimized in detail, ultimately, the analysis was carried out using 13 nm AuNPs in the media of pH 7, and the reaction was perfomed for 10 min at room temperature. Moreover, the effects of interfering substances in the samples were investigated. The melamine can be detected after extraction and centrifugation separation with 10％ trichloroacetic acid and chloroform. The proposed method could be used to detect melamine in milk and eggs with a detection limit of 0.1 mg/L, 2.5 mg/L （S/N＝3）, and the recovery are 95.0%－105.0%, 98.0%－104.0% respectively.

Keywords Melamine; Gold nanoparticles; Colorimetric; Milk; Eggs

（Received 2 August 2011; accepted 5 October 2011）