秦艽抗大鼠高尿酸血症作用机制研究
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【摘要】 目的：探索秦艽抗大鼠高尿酸血症的作用机制。方法：通过检测高尿酸血症大鼠24 h总尿量和尿酸排泄量，采用免疫组化和Western blotting方法来检测高尿酸血症大鼠肾脏阴离子转运蛋白OAT1、OAT3、URAT1蛋白表达及变化探明其作用机制。结果：实验结果表明秦艽能够降低大鼠血尿酸、增加大鼠24 h尿量和尿酸排泄量。结论：秦艽抗大鼠高尿酸血症的作用是通过降低模型组大鼠URAT1的蛋白表达，现提高OAT1、OAT3的蛋白表达来实的。
【关键词】 秦艽； 高尿酸血症； 阴离子转运蛋白
秦艽在临床上用于治疗风湿性关节炎、风寒引起的周身疼痛等，通常具有良好的效果[1]。高尿酸血症是嘌呤代谢紊乱引起的尿酸生成过多和（或）尿酸排泄减少的一组代谢性疾病。据统计，高尿酸血症在人群中的发病率男性高达25.8%，女性为15%[2]，其不仅可以引起痛风性关节炎，而且是心血管疾病和肾脏疾病进展的独立危险因素[3-6]，因此，维持稳定的血尿酸水平对人类的健康有着重要的意义。目前，临床上治疗痛风的药物主要有抑制尿酸生成的别嘌呤醇和促尿酸排泄的丙磺舒、苯溴马隆等，由于这些药物副作用大，使其应用受到限制。因此，借助中医理论开发一种药效稳定、副作用小的天然药物来解决这一难题具有一定的研究价值。传统中医将痛风列入痹症的范畴，秦艽属于龙胆科多年生草本植物，其用药部位为根，现代药理证明其具有非常好的降尿酸效果。
目前，降低血尿酸主要通过抑制尿酸生成和促进尿酸排泄这两个途径来实现的，肾脏是排泄尿酸的主要器官，其中OAT1、OAT3、URAT1这三种转运蛋白在调控尿酸水平方面有着重要的意义。本研究就其是否能够促进尿酸排泄为切入点，使用免疫组化和Western blotting方法，通过检测以上三种蛋白表达水平来探讨秦艽降血尿酸的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 Wistar大鼠[7]，雄性，体重180～220 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号：scxk（京2007-0001）。
1.2 实验试剂 腺嘌呤（美国Sigma公司）、尿酸试剂盒（南京建成生物科技有限公司）、苯溴马龙（宜昌长江药业有限公司）、DAB试剂盒（北京中山金桥生物技术有限公司），苏木素、兔源抗OAT1多克隆抗体、兔源抗OAT3多克隆抗体、兔源抗URAT1多克隆抗体和HRP-羊抗兔IgG都购自北京博奥森生物技术有限公司，脱脂奶粉购自博士德生物工程有限公司。
1.3 实验器材 切片机（德国莱卡）、YDS-47-127液氮生物容器（成都全凤液氮容器有限公司），染色缸、孵育盒、硝酸纤维素膜（NC膜）购自Amersham公司，转膜滤纸购自Whatman公司。
1.4 方法
1.4.1 药液配制 苯溴马龙：根据大鼠与成人药物剂量换算公式，成人（假设体重为70 kg）每日服用100 mg的剂量相当于大鼠每日服用9.0 mg/kg量。将药片压碎，加灭菌热蒸馏水溶解、混匀，配成9.0 mg/ml浓度的混悬液。（1）腺嘌呤：用灭菌热蒸馏水配成溶液，按照100 mg/（kg·d）的剂量灌胃。（2）乙胺丁醇：用灭菌热蒸馏水配成溶液，按照250 mg/（kg·d）的剂量灌胃。（3）秦艽提取物：取秦艽药材，加50%乙醇回流提取三次，每次1.5 h，合并滤液，浓缩至药物浓度为1 g/ml。
1.4.2 对大鼠血尿酸的影响 取Wistar大鼠40只，随机分为四组：空白组、模型组、给药组，阳性组，每组10只，适应性饲养一周后，空白组ig.生理盐水，模型组大鼠ig/d.给予腺嘌呤和乙胺丁醇，给药组大鼠ig/d.给予腺嘌呤和乙胺丁醇后灌胃秦艽提取物，阳性对照组大鼠每日ig.给予腺嘌呤和乙胺丁醇后灌以苯溴马龙，于实验第7天，灌胃1 h后，各组动物摘眼球取血，血液经4000 r/min离心25 min，取上清液，测定血清尿酸值。
1.4.3 对大鼠24 h总尿量和尿酸排泄量影响 大鼠分组及给药同上，于末次给药1 h后，采用代谢笼收集大鼠24 h内尿液，采用全自动生化分析仪检测尿酸浓度，计算24 h尿酸总排泄量。
1.4.4 免疫组化 取Wistar大鼠15只，适应性饲养一周后，随机分为三组，空白组、给药组及模型组，给药方法同上，于末次给药后1 h，将大鼠麻醉，取肾脏，保存在4%甲醛固定液中24 h。采用免疫组化方法，按照相应抗体说明书检测肾脏组织的尿酸转运相关蛋白OAT1、OAT3和URAT1的表达，观察秦艽对尿酸转运相关蛋白的影响。
1.4.5 Western blotting取Wistar大鼠15只，分组及给药方法同上，末次给药1 h后，大鼠麻醉，取其右肾，纵向切开分为两部分，迅速置于液氮中，冷冻后，保存于-70 ℃低温冰箱中。取200 μg组织经研磨粉碎，加入1000 μl新鲜配制、冷蛋白裂解液。裂解液经4 ℃、14000 r/min离心10 min，取上清液并测定蛋白浓度。取40 μg蛋白与上样缓冲液混合，煮沸5 min，置于SDS，电转移到NC膜，用1%脱脂奶粉封闭。用稀释度1：1000相应的多克隆抗体于4 ℃过夜，加入相应的二抗室温下温育60 min。抗体检查按试剂盒说明书进行。
1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0统计学软件对数据进行统计学处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，以P
2 结果
2.1 秦艽对大鼠血尿酸、24 h尿量及尿酸排泄量的影响 灌胃腺嘌呤和乙胺丁醇成功复制了大鼠高尿酸血症模型，秦艽能够降低高尿酸血症大鼠的血尿酸，增加大鼠24 h尿量和尿酸的排泄量。见表1。
2.2 秦艽对大鼠转运蛋白的影响
2.2.1 免疫组化图像分析与处理 免疫组化切片在光学显微镜下观察，对URAT1、OAT1和OAT3在肾组织表达量的分析采用以下方法：在400倍视野下每张切片随机选取互不重叠的10个视野，用Image-proPlusversion 6.0图像分析系统（美国MdeiaCybemeties公司）进行分析。结果发现模型组OATI和OAT3的蛋白表达明显低于空白组，秦艽给药组的OATI和OAT3的蛋白表达明显高于模型组，模型组的URAT1蛋白表达明显高于空白组，秦艽给药组的URAT1的蛋白表达明显低于模型组。
2.2.2 Western-blotting检测结果 用目的蛋白灰度值除以内参蛋白的灰度值所得数据，免疫组化和Western blotting实验结果表明，秦艽能够上调高尿酸血症大鼠OAT1 和OAT3蛋白的表达，降低高尿酸血症大鼠URAT1的蛋白表达。见表2。
3 讨论
模型的复制方法、阳性药的选择要基于实验目的而定，本实验的目的是为了探讨秦艽是否通过促进尿酸排泄而达到降尿酸的作用，由于乙胺丁醇能抑制尿酸的排泄产生高尿酸血症，因此，本实验所采用的模型复制方法为传统的腺嘌呤加乙胺丁醇灌胃法，选择能够促进尿酸排泄的苯溴马龙作为本实验的阳性药。
近年来，已从分子水平证实4种蛋白质参与了尿酸盐在肾小管的转运，其中OATI和OAT3表达在肾小管上皮细胞基底侧膜，负责将尿酸从管周毛细血管转运到肾小管上皮细胞内，完成尿酸分泌的第一步；OAT4命名为人尿酸盐阴离子交换器（URAT1），URATI表达在肾小管上皮细胞刷状缘，负责尿酸的重吸收[8]。这些转运蛋白对尿酸浓度的调控作用，使其成为高尿酸血症药物治疗的重要靶点，本实验通过免疫组化和Western blotting方法发现，秦艽的有效部位能够上调高尿酸血症大鼠OAT1和OAT3蛋白的表达，降低高尿酸血症大鼠URAT1的蛋白表达。这些可能是其发挥抗高尿酸症的作用的重要机制之一，这为中药抗痛风疾病提供了新的科研思路和方法。
参考文献
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（收稿日期：2013-03-27）（编辑：连胜利）