宫颈癌中p53基因多态性的检测及其临床意义

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【摘要】 目的 探讨p53基因多态性在宫颈癌中的表达及其临床意义。方法 采用等位基因特异性PCR(allele specific polymorphism chain reaction,ASP)的方法检测p53基因型在46例宫颈癌患者及84例对照者中的表达。采用SPSS14.0软件分析p53基因多态性与宫颈癌临床特征的关系。结果 p53基因多态性分析显示，Pro/pro基因型在宫颈癌和对照组中的表达差异有统计学意义。HPV状态分层分析，HPV阴性者中Pro/pro基因型在宫颈癌和对照组中的表达差异有统计学意义，HPV阳性者则无显著统计学差异。p53基因多态性与患者的年龄、宫颈癌的临床分期、组织类型、细胞分化程度、肿瘤大小、有无淋巴结转移均无显著相关。不同临床分期、组织类型、分化程度、淋巴结转移的宫颈癌中Pro/pro基因型表达差异与HPV状态无显著相关。 结论 p53基因72密码子Pro/pro基因型可能是HPV阴性妇女患宫颈癌的高危因素。p53基因多态性与宫颈癌临床病理性特征无相关性。

【关键词】 宫颈癌；p53；基因多态性；临床意义

Detection of p53 gene polymorphism in cervical cancer and its clinical implication

LI Canyu,ZHANG Zisen,LIU Jihong.Department of Gynecology and Obstetric,The Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

【Abstract】 Objective To investigate the expression of p53 polymorphism and its relationship with clinical characters of cervical caner.Methods DNA collected from smear was examined by ASP(allele specific polymorphism chain reaction)in 46 cervical cancer and 84 control groups.SPSS 14.0 software was used to analyze statistical difference.Results Pro/pro genotype frequency showed significant difference between patients of cervical cancer and control group.The difference was found only in HPV negative patients,but not in HPV positive ones after subgroup analysis.p53 polymorphism had no correlation with patients’ age at diagnosis,clinical stage,histopathology types,cell differentiation,tumor sizeand lymph node metastasis.Pro/pro genotype frequency between clinical stage,histopathology types,cell differentiation,tumor size and lymph node metastasis were found no correlation to HPV status.Conclusion Pro/pro genotype of p53 polymorphism may play very important role in HPV negative patients of cervical cancer.p53 gene polymorphim has no correlation with pathological features.

【Key words】 Cervical cancer;p53;Gene polymorphism; Clinical implication

宫颈癌在我国妇女中的发病率仅次于乳腺癌，位居第二位。p53基因结构的改变已被发现与多种肿瘤的发生有关，大约50%的恶性肿瘤中发现有p53基因的突变［1］。p53基因第72密码子的多态性与恶性肿瘤发生的关系成为近年研究的热点。Storey A［2］等的研究发现p53基因72位密码子Arg/arg基因型是发生宫颈癌的风险因素，然而在欧洲和亚洲的群体研究结果中并未得到证实［36］。最近研究中发现，p53基因72位密码子Pro/pro基因型的高频率可能与乳腺癌、鼻咽癌、结肠癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤的发生相关［710］。本研究就p53基因72位密码子 Pro/pro基因型与宫颈癌的关系作了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 病例选择 取2002年9月至2004年5月经中山大学肿瘤防治中心妇科收治、经病理证实的宫颈癌患者46例作为病例组，良性疾病患者84例为对照组。病例组中位年龄40.9岁，对照组中位年龄43.8岁，两组患者具有可比性。根据FIGO(2003)分期，宫颈癌组中Ⅰa1期4例，Ⅰb1期24例，Ⅰb2期6例，Ⅱa期10例，Ⅱb期2例；组织类型：鳞癌40例，腺癌3例，腺鳞癌3例；细胞分化：Ⅰ级2例，Ⅱ级8例，Ⅲ级29例，分级不明7例；有淋巴结转移6例，无淋巴结转移40例；宫颈癌体的平均直径为3.25 cm。

1.2 试验方法

1.2.1 标本的取材及DNA的提取 于治疗前取每个患者的宫颈涂片，用95％的乙醇固定15 min。每张涂片用裂解液(50 mmol/L TrisHCl pH=8.5,1 mmol/L EDTA,0.5%Tween,100 μg/ml蛋白酶K)约100 μl，溶解涂片上的宫颈分泌物,将其转到500 μl的离心管中，置于37℃的恒温箱中温育过夜，95℃加热8 min灭活蛋白酶K,5000×g离心5 min取上清液存于80℃冰箱中备用，或直接用于PCR检测。

1.2.2 p53基因多态性的检测 用等位基因特异性PCR(allele specific PCR，ASP)对提取的DNA进行扩增(Gene Amp PCR system 9700),引物序列同Storey A［3］等的研究。以杂合型细胞DNA为阳性对照，双蒸水为阴性对照。对扩增的阳性对照的PCR产物进行测序，并与Genebank中的人类基因组DNA序列(The Human Genome Reference DNA Sequence)进行对比，证实阳性对照的扩增产物为人p53基因第4外显子的片段，且符合率为 98％。反应的总体积为25 μl,包括双蒸水14.8 μl,10 mmol/L 10×Buffer(含Mg2+)2.5 μl,10 mmol/L dNTP 0.5 μl,引物 2 μl(0.5U/μl)，Taq DNA聚合酶0.2 μl和模板DNA 5 μl。试剂均购自申博生物制品有限公司。PCR的循环条件为：94℃ 4 min；然后94℃ 1 min、60℃ 1.5 min、72℃ 1 min共30个循环；最后72℃ 5 min。

1.2.3 p53基因多态性产物电泳 含1×TAE的缓冲液的电泳槽内，PCR产物在2％琼脂凝胶(含1％的溴化乙啶)中电泳30 min(100 V,33 mA)，紫外光下观察。p53基因多态性检测中，引物pro+/p53扩增的产物为177 bp,引物p53+/arg扩增的产物为141 bp。若扩增产物只有一条141 bp的条带，则基因型为Arg/arg纯合子；若扩增产物只有一条177 bp的条带，则基因型为Pro/pro纯合子；若扩增产物同时出现上述两条条带，则基因型为Arg/Pro杂合子。

1.3 统计学处理 统计宫颈癌组患者的年龄、p53基因型分布、临床分期、组织类型、肿瘤细胞分化、肿瘤大小、淋巴结转移与否。用SPSS14.0统计学软件进行统计分析，采用四格表、列联表进行χ2检验比较基因型的分布差异，采用t检验和χ2检验比较p53基因多态性与宫颈癌临床特征之间的关系。P

为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p53基因型在宫颈癌与宫颈良性疾病中的分布 对宫颈癌组及对照组的HPV状态和Pro/pro基因型进行PCR检测，结果显示宫颈癌组中HPV 阳性率为47.8％，对照组中HPV阳性率为20.2％。在所有研究对象中，宫颈癌组Pro/pro基因型频率高于良性疾病对照组，对比差异有统计学意义(OR,3.056;95%CI,1.0768.678)，而其他基因型的比较未显示统计学差异(P>0.05)。以HPV状态进行分层分析，结果显示在HPV检测为阴性的研究对象中，Pro/pro基因型的频率在宫颈癌组高于良性疾病对照组，在两组之间差异有统计学意义(OR:5.250,95%CI:1.33520.646)，而在HPV检测为阳性的研究对象中，Pro/pro基因型频率在宫颈癌和对照组之间差异无统计学意义(OR:1.037,95%CI:0.1995.410)，见表1。

2.2 Pro/pro型与临床病理特征的关系 宫颈癌患者的中位年龄为40.9岁，平均年龄为42.2岁。在宫颈癌组中，p53三种基因型的平均年龄分布差异无统计学意义(P>0.05)。p53基因三种基因型在宫颈癌不同临床分期、组织类型、细胞分化、淋巴结有无转移之间的分布差异无统计学意义(P>0.05)。p53基因Arg/arg、Pro/pro、Arg/Pro基因型的宫颈癌患者的平均肿瘤直径分别为3.37 cm、3.40 cm、2.80 cm。三种基因型的平均肿瘤直径分布差异无统计学意义(P>0.05)。

进一步分层分析Pro/pro基因型与HPV状态和临床病理特征的关系，结果显示Pro/pro基因型在不同临床分期、细胞分化、淋巴结转移亚组中的分布与HPV感染状态无关，差异无统计学意义(表2)。

3 讨论

p53基因第4外显子上的第72密码子存在多态性［11］。这种多态性不仅存在于正常组织中，也常见于皮肤癌、乳腺癌、喉癌、头颈部肿瘤、膀胱癌、食管癌、卵巢癌等肿瘤组织中［12,13］。虽然p53基因第72位密码子Arg/arg基因型的比例较高，也有研究表明该基因型频率与宫颈癌的发生相关，但是这一结论未在大规模群体中得到验证［36］。

近年的研究表明，p53基因第72位密码子Pro/pro基因型可能是一些恶性肿瘤发生的高风险因子［710］，也提示与某些肿瘤类型的临床分期、组织分级等临床病理特征存在相关性。本文对该基因型在宫颈癌中的分布情况进行研究，结果显示病例组Pro/pro基因型比例较对照组明显为多，差异具有显著性。进一步的分析表明，Pro/pro基因型在宫颈癌和良性对照组所表现的显著差异和HPV感染状态有关，这种显著性差异仅存在于HPV阴性的宫颈癌和良性对照病例之间，而存在HPV感染的宫颈癌和良性对照组中则差异无统计学意义。因此本研究结果不支持Arg/arg基因型是宫颈癌的高危因素。而Pro/pro基因型则可能是HPV阴性的妇女患宫颈癌的高风险因素。近来韩国也有研究表明，Pro/pro基因型是该国妇女宫颈腺癌的易患因素［14］，与本研究不同的是，该研究中的这种高风险主要存在于HPV感染的人群。

分析p53基因多态性的分布与临床病理特征的关系，p53基因型在不同临床分期、组织类型、细胞分化的分布的差异同样无统计学意义，这与Jiang［15］等的研究结果相一致。分层分析Pro/pro基因型的宫颈癌患者的临床病理特征与HPV感染状态的关系，也未发现显著差异。这可能因本研究的例数较少，可能存在一定抽样误差，此结论有待进一步扩大样量研究证实。

本研究对宫颈癌中p53基因多态性分布的研究表明，Pro/pro基因型可能是HPV未感染妇女中患宫颈癌的高危因素，这也提示HPV感染和未感染妇女中宫颈癌的发病机制可能存在差异，进一步明确HPV阴性宫颈癌的发病机制可能是今后研究的方向之一。

参 考 文 献

［1］ Levine AJ,Momand J,Finlay CA.The p53 tumour suppressor gene.Nature,1991,351(6326):453456.

［2］ Strorey A,Thomas M,Kalita A,et al.Role of a p53 polymorphism in the development of human papillomavirusassociated cancer.Nature,1998,393(6682):229234.

［3］ Sousa H,Santos AM,Pinto D,et al.Is the p53 codon 72 polymorphism a key biomarker for cervical cancer development A metaanalysis review within European populations.Int J Mol Med,2007,20(5):731741.

［4］ Lee SA,Kim JW,Roh JW,et al.Genetic polymorphisms of GSTM1,p21,p53 and HPV infection with cervical cancer in Korean women.Gynecol Oncol,2004,93(1):1418.

［5］ Niwa Y,Hamajima N,Atsuta Y,et al.Genetic polymorphisms of p73 G4C14toA4T14 at exon 2 and p53 Arg72Pro and the risk of cervical cancer in Japanese.Cancer Lett，2004，205(1):5560.

［6］ Zhou X,Han S,Wang S,et al.Polymorphisms in HPV E6/E7 protein interacted genes and risk of cervical cancer in Chinese women:a casecontrol analysis.Gynecol Oncol，2009，114(2):327331.

［7］ Ghasemi N,KarimiZarchi M,MortazaviZadeh MR,et al.Evaluation of the frequency of TP53 gene codon 72 polymorphisms in Iranian patients with endometrial cancer.Cancer Genet Cytogenet，2010，196(2):167170.

［8］ Kazemi M,Salehi Z,Chakosari RJ.TP53 codon 72 polymorphism and breast cancer in northern Iran.Oncol Res，2009，18(1):2530.

［9］ Zhuo XL,Cai L,Xiang ZL,et al.TP53 codon 72 polymorphism contributes to nasopharyngeal cancer susceptibility:a metaanalysis.Arch Med Res，2009,40(4):299305.

［10］ Katkoori VR,Jia X,Shanmugam C,et al.Prognostic significance of p53 codon 72 polymorphism differs with race in colorectal adenocarcinoma.Clin Cancer Res，2009，15(7):24062416.

［11］ Matlashewski GJ,Tuck S,Pim D,et al.Primary structure polymorphism at amino acid residue 72 of human p53.Mol Cell Biol,1987,7(2):961963.

［12］ Soulitzis N,Sourvinos G,Dokianakis DN,et al.p53 codon 72 polymorphism and its association with bladder cancer.Cancer Lett,2002,179（2）:175183.

［13］ Li T,Lu ZM,Guo M,et al.p53 codon 72 polymorphism(C/G)and the risk of human papillomavirusassociated carcinoma in china.Cancer,2002,95（12）:25712576.

［14］ Roh JW,Kim BK,Lee CH,et al.P53 codon 72 and p21 codon 31 polymorphisms and susceptibility to cervical adenocarcinoma in Korean women.Oncol Res，2010，18(9):453459.

［15］ Jiang P,Liu J,Zeng X,et al.Association of TP53 codon 72 polymorphism with cervical cancer risk in chinese women.Cancer Genet Cytogenet，2010，197(2):174178.