神经节苷脂联合参附注射液对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用

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摘要：目的探讨神经节苷脂（GM1）联合参附注射液对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）的神经保护作用。方法将新生7 d SD乳鼠90只随机分为假手术组、缺血缺氧组（HIBD组）、缺血缺氧+ GM1干预组（GM1组）、缺血缺氧+参附干预组（参附组）及缺血缺氧+ GM1及参附干预组（合用组）。在给药后不同时间点，采用免疫组化法半定量测定脑组织中Bcl-2及Bax含量。结果假手术组海马CA1区可见少量Bcl-2及Bax表达；HIBD后该区Bcl-2及Bax表达均增加，且Bax表达较明显；分别应用GM1、参附注射液治疗后该区Bcl-2表达进一步增加，而Bax蛋白水平下降；联合应用两种药物治疗后该区Bcl-2表达增加、Bax表达下降的趋势更为明显。结论新生大鼠脑缺氧缺血后腹腔注射神经节苷脂或参附注射液均可不同程度减轻大鼠脑损伤,两种药物联合应用对其脑损伤的改善作用更为明显。

关键词:神经节苷脂 参附注射液 脑损伤 Bcl-2 Bax

中图分类号：R743R285.5文献标识码：A文章编号：1672-1349(2011)05-0576-03

Protective Effect of Ganglioside GM1 and Shenfu Injection on Hypoxia-ischemia Brain Damage in Newborn Rats

Zhang Haijiao，Yin Huaiqing，Li Hong，et al

Department of Paediatrics，The First Clinical Medical College，Shanxi Medical University (Taiyuan 030001)

Abstract:ObjectiveTo explore the neuron-protective effect of ganglioside GM1 and of Shenfu injection（SFI） on hypoxia-ischemia brain damage(HIBD) in newborn rats.MethodsSeven-day-old Wistar rats were randomly divided into five groups：Sham-operation group，HIBD group，ganglioside GM1 treatment group，SFI treatment group，and combination treatment group.After the drug injection，the content of Bcl-2 and Bax in brain tissue was measured by immunohistochemical method at different time points.ResultsBcl-2 and Bax were low expressed in sham operation group，but the expression was increased after HIBD，especially for the expression of Bax.While GM1 and Shenfu injection treatment were separated，the expression of Bcl-2 got higher and expression of Bax was over.The most obvious change was happened in combination treatment group.ConclusionGanglioside GM1 and SFI could reduce the brain damage in newborn rats with HIBD.Ganglioside GM1 combined with SFI could enhance the effect for reducing the brain damage.

Key words:ganglioside GM1；Shenfu injection；brain damage；Bcl-2；Bax

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）是指婴儿在围生期、分娩期、出生后发生窒息，导致脑

1）为太原市科技局科技兴市基金资助项目（No.0705-026）

组织缺氧性损伤,是新生儿的常见病之一。 HIE发病机制复杂,涉及多个环节,而细胞凋亡是后期神经细胞缺失和功能障碍的重要原因。本实验主要探讨在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后，应用神经节苷脂（GM1）及参附注射液治疗后其脑组织中Bcl-2,Bax的变化趋势，从理论角度分析,联合应用两种药物对新生大鼠HIE后神经系统功能恢复具有更为明显的改善作用。

1材料与方法

1.1材料实验动物,清洁级，封闭群，新生7 d SD乳鼠，体重12 g ～18 g，雌雄不限，购自山西医科大学动物实验中心。

1.2试剂与药品Bcl-2兔抗大鼠多克隆抗体购自北京中杉试剂公司；Bax兔抗大鼠多克隆抗体购自北京中杉试剂公司；免疫组化二步法检测试剂盒（PV6001）购自北京中杉试剂公司；神经节苷脂注射液系山东齐鲁制药有限公司生产（批号H20103722）；参附注射液系雅安三九药业有限公司生产（批号031118）。

1.3方法

1.3.1动物分组新生7 d SD乳鼠90只，随机分为5组（n=18），假手术组、缺血缺氧组（HIBD组）、缺血缺氧+GM1干预组（GM1组）、缺血缺氧+参附干预组（参附组）及缺血缺氧+GM1及参附干预组（合用组）。

1.3.2动物模型制备参照Rice［1］方法制备HIBD模型，缺血缺氧完成后立即予GM1腹腔注射（20 mg/kg）每日1次；参附组腹腔注射参附注射液（10 mg/kg）每日1次；合用组腹腔注射两种药物。假手术组仅切开颈部皮肤，分离左侧颈总动脉后不予结扎，缝合切口后不予低氧处理。

1.3.3标本制作各组分别于术后6 h、24 h、48 h处死动物取脑组织，分离左侧大脑半球（即颈总动脉结扎侧）做冠切，留取皮层及海马脑组织（5 mm）,放入10%中性甲醛固定液中固定6 h～24 h，然后常规石蜡包埋，切片。

1.3.4HE染色按切片-烤片-脱二甲苯-梯度酒精水化-染色-梯度酒精脱水-二甲苯透明-封片程序行苏木素染色，显微镜下观察脑组织病理变化。

1.3.5免疫组化染色与阳性细胞记数Bcl-2及Bax免疫组化染色采用PV法即免疫组化二步法。切片常规脱蜡；3%H2O2室温孵育15 min；滴加胃酶进行酶修复10 min；滴加Bcl-2和Bax兔抗大鼠多克隆抗体一抗；4 ℃过夜；滴加PV6001二抗，室温孵育20 min；DAB显色；苏木素复染。Bcl-2和Bax阳性染色信号定位于细胞浆，被染成棕黄色或黄褐色颗粒，采用医学图像分析系统分析。

1.3.6统计学处理采用SPSS13.0统计软件处理。计量资料以均数+标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，均数间两两比较采用LSD-t检验。

2结果

2.1HE染色观察细胞假手术组海马组织结构基本正常，细胞排列整齐紧密，形态正常。高倍镜下可见神经元细胞核大而圆，透明，有1个~2个明显的核仁；缺血缺氧组：海马组织结构疏松，大脑皮层、海马细胞排列紊乱，且出现空泡、变性和坏死,正常神经元细胞减少；各干预组：各组大脑皮层、海马细胞变性、坏死明显减少。

2.2免疫组织化学结果

2.2.1Bcl-2表达Bcl-2阳性细胞广泛表达于大脑皮层和海马，为胞浆着色，染色呈棕黄色或黄褐色颗粒。假手术组中Bcl-2蛋白表达较弱，而HIBD组中Bcl-2表达增加，各治疗组中Bcl-2表达进一步增加，尤以合用组明显，差异有统计学意义（P

脑缺氧缺血后神经元死亡是一种凋亡现象。动物实验已发现，缺氧缺血性脑损伤后早期就出现凋亡细胞，以皮层、海马、纹状体等部位为主，尤以24 h凋亡表达最明显［2］。细胞凋亡是涉及多基因调控的复杂主动死亡过程。Bcl-2家族是最主要的凋亡调控基因,在细胞凋亡途径的上游远端,构成一个重要的细胞内凋亡调控点［3-4］。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最重要的一对调控因子,这两类分子的比例决定细胞是否发生凋亡。Bcl-2基因是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因，也是迄今研究最广泛的凋亡调控基因之一。它可以通过多条途径抑制细胞凋亡，其主要机制可能有:抑制线粒体膜间隙中细胞色素的释放，从而阻止半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶级联反应的激活［5］，抑制活性氧的产生［6］,抑制钙离子内流等［7］。 而促凋亡蛋白(如Bax)则以非活性的形式分布于胞浆中或细胞骨架上，当细胞受到死亡信号刺激后，促凋亡蛋白发生构象变化，从胞浆中转位至线粒体外膜，并与膜上的抗凋亡蛋白发生相互作用，使抗凋亡蛋白丧失对细胞凋亡的抑制作用，引起线粒体内各种促凋亡因子的释放，最终导致细胞凋亡［8,9］。

神经节苷脂（Gangliosides,Gg）是一种糖鞘脂,是大多数哺乳动物细胞膜的组成成分，在神经系统中尤为丰富。而单唾液酸四己糖神经节苷脂是哺乳类神经节苷脂的主要种类,它对神经元细胞的分化、生长、轴浆转运和再生起着重要作用［10］。GM1的分子结构是由一个疏水的神经酰胺部分和一个亲水的唾液酸寡糖基团组成。这种结构特征使其容易与细胞外的信息发生相互反应，影响细胞膜的活动而发挥其生物学功能。GM1作为重要的神经保护剂，新生大鼠脑缺血时外源性GM1可以透过血脑屏障，嵌入受损部位神经细胞膜，阻断兴奋性氨基酸神经毒性，调节细胞膜上Na-K+-ATP酶活性，减少脑组织内Ca2+浓度，发挥其抗细胞凋亡作用。张桂莲等［11］的实验证明GM1可使海马CA1区Bcl-2表达和Bcl-2 /Bax比值增高,从而发挥神经保护作用。

参附注射液已广泛应用于临床，在儿科临床也已有应用［12］。参附注射液主要成分为人参皂甙（Rb1）和乌头类生物碱,具有清除氧自由基、抗脂质过氧化、保护内皮细胞作用,保护修复心肌细胞的作用。其对HIE机制可能包括：能抗脂质过氧化反应和促进热休克蛋白（HSP70）表达 ［13］。能清除海马椎体神经元产生的氧自由基,阻滞细胞膜上钙通道活动,减轻细胞内钙离子积聚,保护线粒体膜完整性,防止因Ca2+过度内流至线粒体膜的去极化,改善神经细胞能量代谢［14］。可抑制 NF-κB 活化及细胞间黏附分子TNF-α、 IL-10表达,从而起到脑保护作用。提高超氧化物歧化酶(SOD)活性、增加内源性NO合成、减轻多形核白细胞(PMNs)黏附与聚集，对缺血再灌注损伤具有保护作用。乌头类生物碱作为β2受体激动剂,可增强缺氧心肌收缩力,改善心脏微循环［15］,从而间接改善脑细胞能量代谢等。由此推测参附注射液是通过“多靶效应”起到上调HIE新生大鼠脑组织中Bcl-2蛋白表达及下调Bax蛋白表达,从而减少神经元凋亡。

本实验证实，新生大鼠缺氧缺血后，联合使用GM1及参附注射液对其脑损伤的改善效果较两药单独使用更为明显。推测其机制可能为：在新生大鼠脑缺氧缺血时，两者可以同时透过血脑屏障，同时发挥其神经保护作用，例如阻断兴奋性氨基酸神经毒性，减少脑组织内Ca2+浓度等抗细胞凋亡作用，共同起到上调保护性的基因调控蛋白Bcl-2及下调促凋亡蛋白Bax的表达。初步证明联合使用GM1及参附注射液对治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的疗效,确切改善效果及机制有待进一步探讨。

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作者简介：张海娇（1984―），女，现为山西医科大学在读硕士研究生（邮编：030001）；阴怀清（通讯作者）、栗红、武师润、阴崇娟，工作于山西医科大学第一医院（邮编：030001）。

(收稿日期：2011-01-18)