胰岛素样生长因子-2在婴幼儿血管瘤中的表达及意义
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[摘要]目的：探讨胰岛素样生长因子-2在不同年龄、不同病理分期婴幼儿血管瘤中的表达水平及意义。方法：采用免疫组化SP法检测50例婴幼儿血管瘤、27例血管畸形及5例正常皮肤组织中 IGF-2的表达。应用SPSS13.0统计软件进行数据分析。结果：免疫组化结果显示：婴幼儿血管瘤组和血管畸形组IGF-2的阳性表达率比较，差异具有统计学意义（χ2=7.46，P
[关键词]胰岛素样子生长因子-2；婴幼儿血管瘤；免疫组化
[中图分类号]R732.2 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）05-0769-04
Signification of IGF-2 protein expression in infantile hemangioma
HUANG Qiao-ling1,FENG Xiao-ling2
（1.Department of Plastic Surgery,Wuhan General Hospital of Guangzhou Command,Wuhan 430070,Hubei,China;
2.Department of Plastic Surgery,Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology）
Abstract: Objective To investigate the expression of IGF-2 in different stages of infantile hemangioma. Methods The expression of IGF-2 in different stages of infantile hemangioma was detected by Streptavidin-Peroxidase immunohistochemical method,compared with vascular malformation and nomal skin tissues. Samples of infantile hemangioma and normal skin tissue were obtained from Wuhan Union Hospital. Archived paraffin blocks of vascular malformation samples were obtained from pathology department of Wuhan Central Hospital. All cases have not received any treatment before surgical excision. Results The expression level of IGF-2 protein in infantile hemangioma is higher than those of vascular malformation and nomal skin tissues（P0.05）. The expression level of IGF-2 protein，the age of patient and pathological stage of IH could corelate with each other（P
Key words:insuline-like growth factor 2;infantile hemangioma;immunohistochemistry
婴幼儿血管瘤（Infantile Hemangioma，IH）为良性先天性血管病变，在新生儿的发病率为1%～2%，1岁内高加索幼儿的发病率为5%～10%，男女发病比例为1∶3～5。约三分之一的患儿在刚出生即被发现皮肤有红色斑点，其余大多在出生后两周才被发现[1]。所有婴幼儿血管瘤都表现出特有的病变过程，即瘤体增生后有一自发的缓慢消退现象[2]。颜面部的血管瘤常常会导致患儿外貌受损。一些位于特殊部位的血管瘤则会引起功能障碍，如眼睑血管瘤会导致弱视，呼吸道的血管瘤可压迫气道而影响呼吸功能[3]。
目前尚没有一种假说或者理论可将婴幼儿血管瘤的发病机制全面阐明，这也使得此疾病无较佳的临床治疗。临床医师面对一岁以内的血管瘤患儿，选择恰当的治疗时机和有效的治疗手段显得尤为重要。
近年来有研究表明，胰岛素样生长因子-2 (insuline- like growth factor 2，IGF-2) 的过度表达与恶性肿瘤（如卵巢癌、结肠癌等）及其他增生性疾病联系密切[4]。我们已经知道IGF-2 是一种有丝分裂原，具有凋亡抑制作用[5]。国外有研究人员已运用cDNA微集阵列分析方法证实IGF-2是血管瘤生长潜在的重要调节因子[6]。他们还运用人血管瘤的外植模型，显示IGF-2促进血管瘤体的外扩生长。
本研究根据患儿年龄将婴幼儿血管瘤病例分组，应用免疫组化SP方法，检测不同年龄段、不同病理分期患儿瘤体组织中 IGF-2的蛋白含量，初步探讨IGF-2蛋白表达强度与患儿年龄、瘤体病理分期三者间的关系和意义。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 材料来源：收集武汉协和医院整形外科2009 年 3月～2011年3月间手术切取50例患儿血管瘤组织作为实验组标本，术前均未行任何辅治疗、单纯手术切除并经病理检查和追溯病史证实为婴幼儿血管瘤。上述患儿同期手术时所留取的血管瘤周围正常皮肤组织，共5例作对照。武汉协和医院病理科存档血管畸形石蜡标本27份。血管瘤患儿中男性24例，女性26例，年龄最小者1月龄，年龄最大者3岁龄。瘤体所在部位有头面部、胸部、腹部、背部、四肢等。
1.1.2 材料分组：蜡块切成4μm厚蜡片，常规HE染色后光镜下观察，按组织结构特点进行分期，其中增生期血管瘤标本37例，消退期血管瘤标本13例，血管畸形27例，带血管的正常皮肤5例。
1.2 实验方法
1.2.1免疫组织化学实验主要试剂：一抗：兔抗人IGF-2多克隆抗体,购于武汉博士德生物试剂公司；UltraSensiti veTMS-P超敏试剂盒(包含二抗，生物素标记的羊抗兔IgG)，购于福州迈新生物技术开发有限公司；DAB显色试剂盒，购于武汉博士德生物试剂公司。
1.2.2 IGF-2蛋白的免疫组织化学染色：采用S-P免疫组织化学法，实验操作参照说明书。PBS代替第一抗体作阴性对照。
1.2.3免疫组织化学染色结果及判断：IGF-2以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。使用OLYMBUS-BX50手动光学显微镜，在40倍物镜下，每张免疫组化切片随机选择不重叠的5个视野，每个视野计数至少200个血管内皮细胞，并计数阳性血管内皮细胞占内皮细胞总数的百分比。按阳性细胞百分比进行分级，阳性细胞百分率小于5%为（-），阳性细胞百分率介于5%到20%之间为（+），阳性细胞百分率大于20%为（+ +）。所有标本的红细胞染色阳性。
1.2.4 统计学处理：各组免疫组织化学反应细胞阳性率以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS13.0软件进行统计学处理，组间比较采用卡方检验，有序分组资料的线性趋势检验采用 分解推断，单向有序资料采用行×列表资料的 检验进行分析，P
2 结果
2.1 HE染色结果：按Mulliken分期标准，每张HE染色切片于200及400倍光学显微镜下观察，对实验标本进行分类，其中婴幼儿血管瘤组织50例，血管畸形组织26例，正常皮肤组织5例。血管瘤组织的血管内皮细胞增殖可见，血管畸形组织以血管腔异常为特点，内皮细胞增殖少见。增生期婴幼儿血管瘤组织可见瘤体以内皮细胞为主，圆形内皮细胞呈簇状或团索状，血管腔几乎不可见。血管腔之间可见增生的“间质”细胞，少见结缔组织（图1a）。消退期婴幼儿血管瘤血管腔明显，内衬扁平内皮细胞，间质细胞变少，细胞外基质沉积出现，血管腔外可见多层基膜（图1b）。血管畸形组织中血管腔异常扩张，内皮细胞扁平，无血管内皮细胞增多（图1c）。
2.2 免疫组织化学S-P法染色结果：IGF-2以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应（图2a～图2d）。在增生期血管瘤中，血管内皮细胞胞浆内可见此类棕黄色颗粒，在血管间区域亦可见大量阳性反应细胞。在消退期血管瘤，阳性反应细胞主要为微血管内皮细胞。在血管畸形和正常皮肤组织，亦可见少量阳性反应细胞。
2.3 数据统计及分析：婴幼儿血管瘤组与血管畸形组比较的 χ2=7.46，0.01
3 讨论
3.1 关于婴幼儿血管瘤的发病机制，可大致分为两大类。一类是研究大量扩增的内皮细胞具体来源的内在理论机制，已提出的假说有以下几种：①婴幼儿血管瘤胎盘来源假说；②内皮祖细胞来源假说；③血管瘤干细胞来源假说；④成血管细胞来源假说。
3.2 另一大类研究外周环境因素在血管瘤发生发展过程中所起作用的，目前已提出的影响因素主要有：①雌激素水平异常；②局部低氧分压与缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)；③能分泌细胞因子的间质细胞；④影响细胞凋亡的基因表达异常。
3.3 上述因素中VEGF被认为是最关键性因子之一。现已知VEGF与内皮细胞上的VEGF受体结合后，能引起血管内皮细胞分裂、增殖和迁移，促进新生血管形成[7]。VEGF在新生血管形成的早期起促发作用，通过招募外周细胞和平滑肌细胞促进毛细血管节段和完整血管壁的形成。影响 VEGF 表达的因素有缺氧、癌基因、多种生长因子等[8]。
3.4 近年来，随着对胰岛素家族研究的不断深入，人们认识到胰岛素家族不仅与糖尿病的发生关系密切，而且与肿瘤的发生也有着密切联系[9]。胰岛素家族与VEGF促血管新生作用之间的关系逐渐受到人们的重视。胰岛素家族是一类重要的生长因子，包括胰岛素、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子-2、相应的受体和结合蛋白[10]。IGF-2蛋白是由67个氨基酸组成的单链弱酸性多肽，分子量为7144KD。Kawamoto等研究发现，IGF-2在人胎儿时期的含量远比成年期高，且出生后IGF-2的表达主要在肝脏、神经组织等[11]。
3.5 IGF-2能与两种不同的受体即胰岛素样生长因子受体Ⅰ（insuline-like growth factor receptor Ⅰ,IGF-ⅠR）和胰岛素样生长因子受体Ⅱ（insuline-like growth factor receptor Ⅱ,IGF- ⅡR）结合 ,通过自分泌和旁分泌方式发挥其生物学作用。Matthias Neid等[12]的研究证实，IGF-ⅠR能上调胰腺癌细胞上VEGF的表达，作为IGF-ⅠR两个主要下游分子的胰岛素受体底物-1和-2在促肿瘤血管新生中起到重要作用。其可能通过以下作用途径促进血管生成：①诱导缺氧诱导因子-1α的合成，后者再促进VEGF的转录[13]；②促进VEGF（主要是VEGF-A）及其相应受体（主要为vascular endothelial growth factor receptor-2, VEGFR-2）的结合，两者结合后在下游靶点的酪氨酸磷酸化、细胞Ca2+稳定、NO产生、血管内皮细胞增殖、移行等方面发挥作用。
3.6 Ritter等学者报道IGF-2可能在血管瘤生长调节中起重要作用[14]。他们在2002年运用cDNA微集阵列分析方法发现增生期血管瘤中IGF-2蛋白表达增强。他们还运用人血管瘤的外植模型，显示IGF-2促进血管瘤体的外扩生长。他们的研究还显示，IGF-2在婴幼儿血管瘤体中表达的上调与血管内皮细胞生长因子受体-2表达水平相关。
3.7 本实验通过免疫组织化学方法观察到，IGF-2蛋白的表达水平在婴幼儿血管瘤组与正常皮肤组比较，P
3.8 IGF-2蛋白的表达水平在婴幼儿血管瘤组织与血管畸形组织比较，P0.05，认为IGF-2蛋白在血管畸形组织与正常皮肤组织中的表达差异不具有统计学意义。但YING YU等[30]的研究显示：IGF-2在增生期和消退期婴幼儿血管瘤中均高表达，在血管畸形及正常婴儿皮肤组织中未检出。导致本实验与他们研究结果差异的原因可能是：①正常皮肤组织组取材于血管瘤周围皮肤组织，体内激素水平影响及临近血管瘤瘤体细胞分泌作用均可导致其内IGF-2蛋白水平升高；②本实验正常皮肤组和血管畸形组样本例数较少。
3.9 从表2中可看出：1岁以内的患儿在4～6月年龄段血管瘤内IGF-2蛋白的表达最强，6月龄后随患儿年龄增大IGF-2蛋白的表达强度减弱，1～3岁年龄段IGF-2蛋白表达水平接近阴性。对其进行线性趋势相关分析，总变异、线性回归分量、偏离线性回归分量P值均
3.10 表4为婴幼儿血管瘤年龄和病理分期的比较，应用 检验，P
IGF-2蛋白表达强度在婴幼儿血管瘤增生期组与消退期组中的比较，应用 检验，P
3.11 综合表2～5的结果，可以得出结论：①婴幼儿血管瘤中IGF-2蛋白的表达强度、肿瘤的病理分期和患儿年龄两两间存在关联；②婴幼儿血管瘤的干预治疗应尽早，一般宜在瘤体处于增殖早期或1岁以内时进行；③ IGF-2蛋白的表达状况能在一定程度上反映瘤体的发展趋势。在评估婴幼儿患儿的病情和作出治疗选择时，IGF-2蛋白可能为一有意义的参考因素。
3.12 在本实验HE染色切片中，增生期血管瘤组织中增殖细胞不仅分布于血管管腔区域，在血管之间的区域亦明显可见广泛分布。SP染色切片，见在血管间区域的大量细胞中也有棕黄色颗粒的表达。我们推测，在增生期血管瘤中除了血管内皮细胞还有许多其他细胞增殖，其具体类型和机制尚待进一步研究。
3.13 在后续的工作中，我们可以进行更深入的研究，将1岁以内各个月龄的婴幼儿血管瘤瘤体内IGF-2蛋白的表达进行定量分析，以明确IGF-2蛋白的表达与年龄及病理分期的关系，为婴幼儿血管瘤早期药物干预治疗的时间选择提供理论支持。本研究对于1岁以内该类患儿的低创、有效的治疗方案的制定有一定的参考意义。
总之，我们有理由相信--进展性血管瘤的干预性治疗是可能的，IGF-2或其受体有望作为早期干预的有效靶点。
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[收稿日期]2011-12-17 [修回日期]2012-02-12