加工工艺对石榴叶茶酚类物质及抗氧化活性的影响
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摘要：为比较不同加工工艺对石榴叶茶酚类物质及抗氧化活性的影响，采用叶龄约1个月充分展开的石榴鲜叶，杀青烘干作为对照，按照传统的加工工艺分别制成绿茶和红茶，采用分光光度法和HPLC法分析了茶样中的多酚类物质，通过测定茶样对DPPH·自由基的清除能力来评价其抗氧化活性。结果表明，与干叶相比，绿茶中总酚及儿茶素含量基本保持不变，红茶中总酚和儿茶素分别下降了30.8%和60.3%，抗氧化活性表现明显下降；红茶中茶红素和茶黄素分别增加了194.3%和181.4%，而绿茶中茶红素和茶黄素稍有增加；绿茶和红茶中鞣花酸分别减少了6.3%和9.3%。因此，加工成绿茶可保持较高的多酚含量和抗氧化活性，加工成红茶则可改善茶的感官品质。
关键词：加工工艺；石榴叶茶；鞣花酸；儿茶素
中图分类号：Q946.84+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）20-5037-04
Effects of Processing Techniques on the Phenolic Constituents and Antioxidant Activity of Pomegranate Leaf Tea
ZHANG Li-hua1，2，WANG Yu-hai2，ZHAO Gui-mei3，ZHANG Yuan-hu1
（1. State Key Laboratory of Crop Biology/Life Science College， Shandong Agricultural University， Taian 271018，Shandong，China；
2. Life Science College， Zaozhuang University， Zaozhuang 277160，Shandong，China；
3. Zaozhuang Vocational College， Zaozhuang 277800，Shandong，China）
Abstract： The objective of this study was to investigate the effects of processing techniques on the phenolic constituents and antioxidant activity of pomegranate leaf tea. The fresh leaves after sprouting 1 month were oven-dried at 80 ℃， made respectively into green tea and red tea with traditional techniques. The results showed that contents of total phenolics and catechins in greea tea were kept unchanged comparing with dried leaves. But those in red tea decreased 30.8% and 60.3%， respectively. The antioxidant activity of red tea decreased obviously. The contents of thearubigin and theaflavin in red tea increased 194.3% and 181.4%， but there was significantly increase in green tea. In addition， the contents of ellagic acid decreased both in green tea （6.3%） and in red tea（9.3%）. Therefore， green tea made from pomegranate leaves had significantly higher contents of total phenolics and antioxidant activity. The sensory quality of red tea was improved.
Key words： processing techniques； pomegranate leaf tea； ellagic acid； catechins
石榴（Punica granatum L.）叶中含有丰富的生物活性物质，包括多酚、黄酮及三萜类等，尤以多酚含量最高，可达干重的10%～20%，包括儿茶素类、鞣花酸、没食子酸等[1-3]。研究表明石榴多酚具有多种生物活性，能与自由基发生反应，表现较强的抗氧化能力[4]，另外，还具有抗菌、抗肿瘤、降血脂以及防治心脑血管疾病等活性[5，6]。近年来， 在亚洲和欧美等国家， 掀起了开发利用石榴叶的热潮， 并研发出多种产品， 石榴茶是其中的典型代表。石榴茶是以石榴树的嫩梢或树叶为原料， 按照茶叶加工工艺制成的茶类固体饮料。目前， 国内外关于石榴叶生物活性方面的研究较多， 而对加工工艺方面的研究较少， 对不同工艺加工的石榴叶茶酚类物质及抗氧化活性的比较研究未见报道。本试验按照绿茶和红茶加工工艺， 将同一批石榴叶分别制成绿茶和红茶， 通过分析感官品质、化学成分及抗氧化活性， 研究不同加工工艺对石榴茶品质的影响， 为科学开发石榴叶资源提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
鲜叶于2009年5月15日在枣庄石榴园采摘，品种为大青皮石榴。采摘标准为叶龄约1个月充分展开的叶片。
1.2 仪器与试剂
DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；UV-2550 紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；数显HH-4恒温水浴锅（国华电器有限公司）；高效液相系统（Waters600泵2487双波长紫外检测器，美国Waters公司）。
儿茶素标准品为Sigma公司产品，鞣花酸标准品由清华大学邢东明教授惠赠，液相色谱用甲醇为色谱纯，去离子水，其他试剂为国产分析纯。
1.3 方法
1.3.1 石榴叶茶加工 将部分石榴鲜叶用鼓风干燥箱在105 ℃下杀青处理15 min，然后在65 ℃下充分干燥作为对照；其余鲜叶分别按绿茶、红茶的加工工艺制成绿茶和红茶，其中绿茶工序为：鲜叶摊放杀青做形炭火炒锅炒制干燥；红茶工序为：鲜叶萎凋揉捻发酵快烘复揉炭火烘笼干燥。
1.3.2 多酚溶液的提取 干叶、绿茶和红茶经研磨成粉，并过40目筛。取0.2 g粉状样品置于锥形瓶中，加入50%（V/V）甲醇溶液20 mL，65 ℃水浴浸提2 h，过滤后的滤渣再浸提1次，合并滤液后定容至50 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤后用于HPLC分析鞣花酸和儿茶素含量。
1.3.3 茶样的感官审评 由茶叶审评专家对绿茶和红茶的外形、汤色、香气、滋味、叶底进行审评。
1.3.4 含水量测定 采用105 ℃烘干称重法测定，其计算公式为：含水量=（初始质量-充分干燥后质量）/初始质量×100%。
1.3.5 总酚含量测定 采用Folin-Ciocalteu比色法测定样品的总酚含量，以没食子酸（GA）为标准品。
1.3.6 鞣花酸、儿茶素含量测定 采用高效液相色谱外标法[7-9]定量分析。其色谱柱为Symmetry C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为甲醇，B相为0.2%磷酸，梯度洗脱，0～10 min：A相10%30%（V/V，下同）、B相90%70%，10～40 min：A相30%100%、B相70%0%；洗脱液流速1 mL/min，检测温度为30 ℃，进样量20 μL，鞣花酸和儿茶素的检测波长分别为254 nm、210 nm。
1.3.7 标准品的制备 精确称取鞣花酸标准品15.92 mg，用二甲亚砜溶解并定容至50 mL，制成0.318 4 mg/mL溶液，过0.45 μm的微孔滤膜，作为鞣花酸标准品溶液；精确称取儿茶素标准品10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL， 浓度为10 μg/mL，过0.45 μm的微孔滤膜，作为儿茶素标准品溶液。
1.3.8 茶黄素和茶红素含量测定 采用Roberts法[10]。称取茶样9 g，置于500 mL锥形瓶中，加沸水375 mL，于沸水浴10 min，用脱脂棉过滤，冷却。吸取滤液50 mL，注于分液漏斗中，加乙酸乙酯50 mL，振摇（避免形成乳浊液）。吸取乙酸乙酯层25 mL，注于分液漏斗中，加25%（m/V）的碳酸氢钠溶液25 mL，强烈振荡30 s，静置分层，弃去水层，立即吸取乙酸乙酯层4 mL，加甲醇定容至25 mL（溶液A）。吸取水层2 mL，加水稀释至10 mL，再加甲醇定容至25 mL （溶液B）。另取水层2 mL，加饱和草酸溶液2 mL和水6 mL，再加甲醇定容至25 mL（溶液D）。吸取isobutyl methyl ketone层25 mL，注入分液漏斗中，加入25%碳酸氢钠溶液25 mL，强烈振荡30 s，静置分层，弃去水层，立即吸取乙酸乙酯层4 mL，加甲醇定容至25 mL（溶液C）。于波长380 nm处测定溶液A、B、C、D的吸光度EA、EB、EC、ED。计算茶黄素和茶红素的含量。
茶黄素含量=EA×2.25×100%
茶红素含量=（2EA+2ED-EC-2EB）×7.06×100%
1.3.9 清除DPPH·自由基能力测定 参照文献[11]中的方法：向3 mL浓度为0.1 mmol/L的DPPH·甲醇溶液中加入一定量的试样（空白对照用等量去离子水代替），总体积用去离子水补充至4 mL，用力摇匀，室温静置30 min后，测定DPPH·混合溶液在517 nm处吸光值（A），用2.5 mL甲醇与0.5 mL试样混合液调仪器零点，以扣除本底对照。自由基清除率=（A0-A样）·A0-1×100%。每种试样加入一定量，作曲线方程，求出达到50%清除率时所需样品的浓度（即IC50），用IC50来比较各个样品对DPPH·自由基清除能力大小。
2 结果与分析
2.1 茶样的感官审评结果
绿茶和红茶样的感官评审结果如表1所示。从表1中可知，不同工艺对石榴茶感官指标的影响明显，石榴叶绿茶绿汤绿叶；石榴叶红茶红汤红叶，香气高甜，滋味甜醇等。
2.2 茶样含水量
干叶、绿茶和红茶的含水量结果如表2所示。其中干叶、绿茶、红茶的含水量分别为4.5%、5.3%、4.6%，绿茶和红茶的含水量均符合干茶含水量小于6%的标准。
2.3 茶样中总酚、鞣花酸及儿茶素含量
干叶、绿茶、红茶中的总酚含量（占干重含量）测定结果如表2所示，干叶、绿茶、红茶的总酚含量分别为115.05、114.29、79.58 mg/g。若以干叶中的总酚含量为100%，绿茶中总酚含量与干叶相比几乎没有变化，而红茶下降了30.8%。
采用RP-HPLC法分析（检测波长254 nm、210 nm）干叶、绿茶和红茶中的鞣花酸、儿茶素含量，外标法定量，其中标样图谱见图1-A和图2-A，干叶图谱见图1-B和图2-B，绿茶和红茶的RP-HPLC图谱与干叶的类似，图略。鞣花酸、儿茶素的含量测定结果见表2，其结果表明，干叶、绿茶、红茶中鞣花酸含量分别为2.36、2.21、2.14 mg/g，相对于干叶而言，绿茶和红茶中的鞣花酸含量变化均较小，仅减少6.4%和9.3%；干叶、绿茶、红茶中儿茶素含量分别为7.16、6.69、2.84 mg/g，相对于干叶而言，绿茶中儿茶素含量下降了6.6%，而红茶中儿茶素含量下降了60.3%。
2.4 茶样中茶红素和茶黄素含量
干叶、绿茶和红茶中的茶红素含量测定结果见表2。与干叶中茶红素相比，绿茶仅上升了5.2%，而红茶则增加了194.3%。说明在红茶加工过程中，茶红素含量显著上升。
茶黄素在干叶、绿茶、红茶中的含量测定结果见表2。相对于干叶而言，绿茶中茶黄素含量提高约9.3%，而红茶中茶黄素含量增加了181.4%。
2.5 抗氧化活性
对DPPH·自由基的清除能力常被用于表示物质抗氧化能力的大小[12，13]，通常以DPPH·自由基的半抑制浓度（IC50）表示（IC50与抗氧化能力成反比例关系）。样品的IC50结果见图3，绿茶（56.77 μg/mL）与干叶（56.32 μg/mL）的抗氧化能力基本一致，红茶（79.34 μg/mL）的抗氧化能力明显低于干叶和绿茶（P
3 讨论
本文采用了分光光度计法和RP-HPLC法系统地研究了石榴叶中的主要多酚类物质在绿茶、红茶加工中的变化。比较几种酚类物质的含量，与干叶相比绿茶中多酚总量几乎没有变化，而红茶多酚总量下降了30.8%；绿茶中儿茶素含量变化也较小，而红茶中儿茶素含量却下降了60.3%；绿茶中茶红素和茶黄素稍有增加，而红茶中茶红素和茶黄素增加明显。这主要是由于绿茶为非发酵茶，在加工中首先采用高温杀青迅速使多酚氧化酶和过氧化酶等酶系失活，有效地抑制了多酚类物质的氧化，绿茶中多酚总量与干叶中多酚总量几乎一致。红茶为全发酵茶，红茶发酵的化学本质是由于多酚类物质特别是儿茶素类在多酚氧化酶的作用下发生氧化反应，生成茶黄素、茶红素和茶褐素等物质，同时在儿茶素类的氧化过程中发生了一系列的偶联氧化反应，从而形成红茶特有的色、香、味等品质特征[14]。由于发生的氧化作用剧烈，尽管儿茶素的氧化产物茶黄素、部分茶红素、部分茶褐素为可溶性多酚类物质，但有相当一部分的茶红素和茶褐素以及儿茶素氧化过程中的中间产物邻醌类物质会与蛋白质结合形成不溶于水的化合物沉着于叶底，外观上表现出叶底为红褐色，从数量上则表现为茶汤中的多酚显著下降。本试验结果表明，红茶中的多酚总量与干叶相比，下降幅度为30.8%，而有文献报道普通红茶水溶性多酚下降幅度达43.8%[14]，可能是因为不同种类植物的多酚组成存在差别，石榴叶中儿茶素类在多酚总量中所占比例较低。
红茶中儿茶素含量下降明显，而鞣花酸变化不大，表明在红茶发酵过程中酚类物质各种成分并非均一地被氧化，可能儿茶素类更容易被氧化。茶样中的茶黄素和茶红素含量的Roberts法测定结果表明，干叶和绿茶中存在一定量的茶黄素和茶红素，可能是由于鲜叶在杀青之前的采摘、运输及摊放过程中鲜叶的儿茶素在多酚氧化酶和过氧化物酶的作用下，发生一定程度的氧化形成了茶黄素和茶红素。研究表明多酚是石榴叶中发挥抗氧化作用的主要成分[4，5]，本试验结果显示绿茶清除自由基的能力与干叶基本一致，而红茶清除自由基的能力却明显下降，抗氧化能力与其总酚含量表现出正相关性，也再一次印证了这一观点。
4 小结
结果表明， 不同加工工艺对石榴叶茶的感官品质和化学成分影响显著。按本试验的加工方法制成的石榴叶绿茶和红茶基本能够达到绿茶和红茶的品质要求， 没有产生特异气味，口感较好。比较而言，不经发酵的石榴叶绿茶的总酚含量和抗氧化活性较高；而发酵工艺可以较好地改善石榴茶的香气品质， 所制石榴叶红茶表现出甜香特征，2种茶叶各具特色，能适应不同消费者的需求，而对石榴叶红茶的香气成分及形成机理需作进一步研究。
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