鳜鱼肌球蛋白重链基因的原核表达及多克隆抗体的制备
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摘 要 肌球蛋白重链（MyHC）是肌肉中的主要结构和功能蛋白，在肌肉收缩过程中起关键作用．根据鳜鱼肌球蛋白重链基因中高亲水性区域DNA设计一对特异性引物，将该基因片段亚克隆到pET32a质粒，构建重组表达载体并转化入大肠杆菌BL21中．诱导条件优化实验结果显示，该菌株经0.8 mmol/L IPTG诱导3 h可大量表达融合蛋白．将经亲和层析纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体．ELISA和免疫组化测试结果表明：此抗体有较好的特异性和抗原性．鳜鱼MyHC基因表达的研究为深入研究肌球蛋白重链的功能特性及其对肉质性状的影响奠定基础，为提高鱼类肉质提供理论基础和技术支持．
中图分类号 Q785 文献标识码 A 文章编号 10002537（2012）06006707
肌球蛋白是肌肉主要构成蛋白质之一．它由Kuhne于1859年首先报道，之后于1864年在研究骨骼肌收缩时发现并命名［1］．肌球蛋白不仅是基础蛋白收缩系统主要成分，也是一种复杂多聚体蛋白，在真核生物肌肉收缩过程中起到很关键作用［23］．在不同的动物种类之间，乃至鱼类不同品种间，肌球蛋白结构和表达存在着种属间差异性．大部分研究工作主要针对脊椎动物骨骼肌肉（主要是兔和鸡）、心脏肌肉、数种平滑肌而进行，同时也包括部分非肌肉系统肌球蛋白的研究．在鱼类中研究较多的是平滑肌组成的心肌肌球蛋白和横纹肌组成的肌肉肌球蛋白［4］．肌球蛋白不同类型的重链基因全序列克隆测序在多种脊椎动物中已经完成，其中包括大鼠（Rattas norvergicus）［5］、鸡［6］、人 ［7］以及鱼类中的斑马鱼［8］、大头鱼、虹鳟［9］、鲤鱼［10］，大黄鱼［11］和鳜鱼［12］等．因此，对鱼类肌球蛋白分子研究已扩展到不同鱼类品种肌球蛋白重链、轻链的基因克隆分析及其表达．Lied和Decken采用生物化学方法分离提取出虹鳟肌球蛋白重链，并采用此蛋白作为抗原制备出多克隆抗体，鉴定出其结合蛋白［11］．Crockford等［13］和Goldspink等［14］采用哺乳动物cDNA序列为引物从鲤鱼基因文库中克隆出其肌球蛋白重链基因，且证实此类基因表达受环境因子所控制；Kato和Konno测定出鲤鱼重链氨基末端和羟基末端分子结构和调节区域［15］．有关鱼类肌肉特异性基因肌球蛋白轻链（myosin light chains，MLC）、肌球蛋白重链（myosin heavy chains，MyHC）的cDNA序列分析所获取的数据，为蛋白质和基因结构进化分析提供基础．这些克隆和分离的基因已经用于研制核酸杂交探针，来研究肌球蛋白基因家族转录产物特异性组织表达、进化，以及染色体定位或突变等．
湖南师范大学自然科学学报 第35卷第6期
刘希良等：鳜鱼肌球蛋白重链基因的原核表达及多克隆抗体的制备本研究旨在通过将鳜鱼肌球蛋白重链基因片段亚克隆到pET32a质粒，构建出重组表达载体，大量诱导表达此蛋白，制备鳜鱼肌球蛋白重链多克隆抗体，为日后分析鳜鱼肌球蛋白重链基因表达对其肉质性状的影响，进而提高鱼类肉质品质提供理论基础和技术支持．
1 材料与方法
1.1 实验材料与主要试剂
体重1 kg 左右的鲜活鳜鱼购买于长沙水产市场，剪腮放血后取背部白色肌肉，-80 ℃冰箱保存备用．大肠杆菌菌种BL21（DE3）和DH5α均购于北京天根公司．原核表达载体pET32a为本实验室保存．限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ购于TAKARA公司；Trizol试剂购于Invitrogen公司；100 bp Marker、MarkerⅢ、PCR扩增所需的试剂以及一抗AntiHis Antiboby 和二抗羊抗鼠购于北京天根公司；T4 DNA连接酶、低相对分子质量标准预染及非预染蛋白质Marker购于Fermentas公司；DNA胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于Promega公司；His融合蛋白纯化预装柱购于上海悦克生物科技有限公司．羊抗兔辣根过氧化物酶标二抗、DBA显色试剂盒购于武汉博士德生物公司．其余化学试剂均为国产分析纯．
1.2 试验方法
1.2.1 引物设计 根据作者已克隆得到的鳜鱼MyHC全长序列（GenBank：HQ829291）及原核表达载体pET32a的载体图谱，利用Primer Premer5.0软件设计一对引物，其序列分别为：
上游引物P+ 5′CAGAATTCATGGAAGAGTCCATTGAGGCTG3′（双下划线部分为引入的EcoRⅠ 酶切位点，粗体字为引入的起始密码子）；
下游引物P-5′GCGAAGCTTCTAGTTCCTCTTGATTTGCTCC3′（双下划线部分为引入的Hind Ⅲ 酶切位点，粗体字为引入的终止密码子）．
1.2.2 目的基因PCR扩增 采用Trizol一步抽提法提取鳜鱼肌肉组织的总RNA后根据反转录试剂盒（Fermentas）合成第一链cDNA，并以其为模板进行PCR扩增．PCR扩增条件为：94 ℃预变性 5 min； 94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃反应10 min．PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后用DNA胶回收试剂盒进行纯化．
1.2.3 原核表达载体构建 pET32a质粒经EcoRⅠ和Hind Ⅲ 双酶切处理回收后与同种酶双酶切后的PCR纯化产物在T4 DNA连接酶的作用下16 ℃过夜，将目的基因定向连接到pET32a载体上，再转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，接种于含50 mg/L氨苄青霉素LB固体培养基平板上37 ℃过夜培养，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，提取质粒进行双酶切鉴定，挑选阳性克隆送上海生工生物有限公司测序．
1.2.4 重组质粒的原核表达及重组蛋白的纯化 把构建好的表达载体pET32aMyHC转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，取单个菌落接种到LB液体培养基中，37 ℃振荡过夜，取上述培养物以体积比1∶ 100比例接种于200 mL LB液体培养基，37 ℃振荡培养3 h左右，至OD600 值达0.5时，取1 mL菌液作为诱导前对照，分别加入终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mmol/L的IPTG，37 ℃分别诱导1、2、3、4、5 h，收集菌液进行150 g/L SDSPAGE电泳，观察不同IPTG浓度和诱导时间对目的蛋白表达量的影响．
1.2.5 抗血清的制备 用 NiNTA 纯化表达的鳜鱼MyHC融合蛋白，然后将纯化的MyHC融合蛋白皮下多点注射新西兰兔，共免疫3次．注射的抗原均为MyHC蛋白与弗氏完全佐剂按体积比1∶ 1混合液．首次免疫后，每隔两周加强免疫一次．末次加强免疫后两周采集少量血液，ELISA检测血清抗体效价．之后，颈动脉放血，离心分离血清，即得到鳜鱼MyHC蛋白的多克隆抗体，分装后-80 ℃保存．
1.2.6 Western blot分析抗体特异性 使用哺乳动物细胞蛋白提取试剂盒提取鳜鱼肌肉组织总蛋白，-20 ℃保存备用．分别取空白质粒pET32a细菌裂解液、鳜鱼肌肉总蛋白、纯化的MyHC蛋白，经100 g/L SDSPAGE电泳后湿法转到NC膜上，使用50 g/L脱脂奶粉/TBST 4 ℃封闭过夜．加入一抗（兔抗MyHC血清，浓度比1∶ 1 000稀释）4 ℃过夜孵育，TBST清洗3次后加入二抗（HRP标记的羊抗兔IgG，浓度比1∶ 2 000稀释），TBST清洗，HRPDAB显色，至出现明显条带后终止反应．
1.2.7 免疫组化分析抗体的特异性 石蜡切片脱蜡、水化；3%（体积分数）H2O2 室温孵育15 min；蒸馏水冲洗，微波炉内抗原修复15 min；自然冷却后，蒸馏水冲洗；PBS冲洗3次，每次5 min；50 g/L BSA室温封闭30 min；倾去封闭液，滴加浓度比1∶ 2 000稀释的兔抗MyHC多克隆抗体（一抗），室温孵育1 h；PBS冲洗3次，每次5 min；滴加二抗生物素标记兔IgG（浓度比1∶ 1 000），室温孵育20 min；PBS冲洗3次，每次5 min；BCIP/NBT显色；自来水冲洗，核固红轻度复染，水洗，干燥后水溶性封片剂封片，镜检．用PBS代替一抗作为阴性对照．
2 实验结果
2.1 重组表达载体pET32aMyHC的构建
将重组表达质粒pET32aMyHC经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定结果如图1．其中，大于4 500 bp条带为酶切载体大小，500 bp左右的条带为目的基因片段大小．同时以单菌落为模板，经菌落PCR鉴定，结果如图2，可见在500～600 bp间有一条明显的特异条带。
2.2 鳜鱼MyHC原核表达及条件优化
将重组表达载体pET32aMyHC（实验组）和空载体pET32a（对照组）转化到宿主菌BL21中，分别利用IPTG诱导，经SDSPAGE检测结果如图3和图4．其中，对照组显示一条相对分子质量约为17 000的特异性条带，即为pET载体的His标签蛋白；而实验组在相对分子质量约40 000处出现一条较明亮的条带，即为HisMyHC融合蛋白．His标签蛋白的相对分子质量约为17 000，而插入的小清蛋白目的片段预测其蛋白相对分子质量大约为25 000，因此，MyHC融合蛋白的相对分子质量理论上接近40 000，这与SDSPAGE电泳结果一致，表明重组表达质粒pET32aMyHC经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21中成功表达出HisMyHC融合蛋白．
M：蛋白Marker ； 1～5：不同IPTG浓度诱导的含pET32aMyHC的BL21菌体，其IPTG浓度依次为0，0.2，0.6，0.8，1.2 mmol/L；6：0.8 mmol/L IPTG诱导的含pET32a的BL21菌体
为了获得稳定的目的基因片段和可溶状态的重组蛋白，克隆片段起始位置应位于保守性较高且亲水性高的区域．作者在设计引物前利用DNAstar软件对鳜鱼肌球蛋白重链基因进行亲/疏水性预测［16］，结果显示鳜鱼肌球蛋白重链基因亲水性氨基酸多集中于850～1 983位．分析鳜鱼MyHC的保守结构［17］，作者选择在Myosin_tail_1亲水性氨基酸集中的区域（1 404～1 592位氨基酸）对应的核苷酸序列进行克隆和表达．基因的高效表达是在载体、基因和受体细胞的协同作用下完成的，主要受启动子、SD序列、转录终止序列、载体系统等因素的影响［1821］．宿主的选择及培养条件的控制等因素对外源基因在原核细胞中的表达效率也有很大影响．本实验所选用的表达载体大肠杆菌BL21具有T7启动子，可通过化学诱导高效地表达外源蛋白，目的蛋白前端的促溶蛋白（相对分子质量约为17 000）可以增加蛋白的表达及可溶性．同时，BL21含有6个组氨酸标签，可以提高外源表达蛋白的表达效率而不影响目的蛋白的高级结构，从免疫组化和免疫印迹结果来看， 作者表达出的带有His标签的蛋白也没有影响到抗原抗体特异结合的性质［22］．同时多聚组氨酸标签对外源重组蛋白的纯化也具有一定的作用．
进行融合蛋白诱导时， 蛋白极易以包涵体的形式表达， 而包涵体形成后的缺点是需变性、 复性等复杂处理过程后才能得到可溶性融合蛋白质．为了避免变性复性等复杂过程，通过改变诱导的时间和 IPTG的浓度，摸索到最适宜的条件为0.8 mmol/L IPTG诱导3 h．
肌球蛋白重链（ MyHC）具有ATPase活性、肌动蛋白结合位点以及a螺旋卷曲螺旋尾部等重要特性，是决定肌纤维收缩性质的主要分子之一．本研究以前期研究中已经克隆的鳜鱼MyHC序列［2324］为目的基因，利用大肠杆菌BL21作为表达载体，对目的基因进行原核表达载体的构建和多克隆抗体的制备．研究成果为进一步研究肌球蛋白重链对肉质的影响，提高优良肉质性状提供理论支持．
参考文献：
［1］ SELLERS J R， GOODSON H V， WANG F. A myosin family reunion［J］. J Muscle Res Cell Motil， 1996，17（1）： 722.
［2］ HOOPER S L， THUMA J B. Invertebrate muscles： muscle specific genes and proteins［J］. Physiol Rev， 2005，85（3）：10011060.
［3］ MUNAKATA T. Crystal engineering using multiple hydrogen bonds［J］. Tetrahedron Lett， 2004，108（38）：5596.
［4］ WEEDS A G. Light chains from slowtwitch muscle myosin［J］. Eur J Biochem， 1976，66（1）：157173.
［5］ STREHLER E E， STREHLERPAGE M A， PERRIARD J C， et al. Complete nucleotide and encoded amino acid sequence of a mammalian myosin heavy chain gene. Evidence against introndependent evolution of the rod ［J］. J Mol Biol， 1986，190（3）：291317.
［6］ MOLINA M I， KROPP K E， GULICK J， et al. The sequence of an myosin heavy chain gene and isolation of its corresponding cDNA ［J］. J Biol Chem， 1987，262（14）：64786488.
［7］ JAENICKE T， DIEDERICH K W， HAAS W， et al. The complete sequence of the human betamyosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product［J］. Genomics， 1990，8（2）：194206.
［8］ BRYSONRICHARDSON R J ， DAGGETT D F， CORTES F， et al. Myosin heavy chain expression in zebrafish and slow muscle composition［J］. Dev Dyn， 2005，233（33）：10181022.
［9］ MC GUIGAN K， PHILLIPS P C， POSTLETHWAIT J H. Evolution of sarcomeric myosin heavy chain genes： evidence from fish［J］. Mol Biol Evol， 2004，21（6）：10421056.
［10］ MURAMATSUUNO M， KIKUCHI K， SUETAKE H， et al. The complete genomic sequence of the carp fast skeletal myosin heavy chain gene ［J］. Gene， 2005，349（11）：143151.
［11］ LEID E A， VON DER DECKEN. Purification of fish muscle myosin heavy chain and quantification of the specific polyribosomebond polypeptide［J］. Biochem J， 1985，232（2）：467470.
［12］ ZHANG J S， CHU W Y， CHEN J， et al. cDNA cloning and expression analysis of myosin heavy chain gene（MHC）of the Mandarin fish， Sniperca kneri ［J］. Aquacuture Reseach， 2009，40（4）：412418.
［13］ CROCKFORD T， JOHNSTON I A. Isolation of unstable myosins and the analysis of light chains by capillary electrophoresis［J］. Anal Biochem， 1995，231（1）：2026.
［14］ GOLDSPINK G， TURAY L， HANSEN E， et al. Switches in fish myosin genes induced by environment temperature in muscle of the carp［J］. Symp Soc Exp Biol， 1992，46：139149.
［15］ KATO S， KONNO K. Filamentforming domain of carp dorsal myosin rod［J］. J Biochem， 1993，113（1）：4347.
［16］ BARTLETT G J， TODD A E， THORNTON J M. Inferring protein function from structure［J］. Methods Biochem Anal， 2003，44：387407.
［17］ 符贵红.鳜鱼肉质营养成分分析及肌球蛋白重链基因克隆与表达［D］.长沙：湖南农业大学， 2007.
［18］ SHINE J， DALGARNO L. Terminalsequence analysis of bacterial ribosomal RNA. Correlation between the 3′terminalpolypyrimidine sequence of 16S RNA and translational specificity of the ribosome［J］. Eur J Biochem， 1975，57（1）：221230.
［19］ STUDIER F W， MOFFATT B A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective highlevel expression of cloned genes［J］. J Mol Biol， 1986，189（1）：113130.
［20］ 赵发兰，周瑞雪，成 嘉，等.鳜鱼与鲢鱼肌球蛋白轻链2启动子的克隆及其序列比较分析［J］.湖南师范大学自然科学学报， 2011，34（1）：7579.
［21］ 农小献，赵发兰，宾石玉，等.斑鳜轻链3基因（MLC3）cDNA的克隆及纵向表达分析［J］.湖南师范大学自然科学学报， 2011，34（2）：7983.
［22］ 宋小燕， 耿梅梅， 褚武英， 等. 从大肠杆菌中表达、纯化宁乡猪N乙酰谷氨酸合成酶并制备其多克隆抗体［J］. 激光生物学报， 2008，17（6）：750755.
［23］ CHU W Y， FU G H， CHENG J， et al. Gene expression profiling in muscle tissues of the commercially important teleost， SiniPerca chuatsi L［J］. Aquacul Int， 2010，18（4）：667678.
［24］ 蒙 涛，丁 蜂， 褚武英，等.鳜肌肉组织cDNA文库构建及其ESTs分析［J］. 淡水渔业， 2009，39（4）：2933.