头孢噻吩钠无菌检查法的研究
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【摘 要】 目的：依据中国药典2010年版无菌检查的相关规定，通过试验，建立头孢噻吩钠无菌检查法。方法：用规定各种试验菌，并用β-内酰胺酶进行试验。结果：头孢噻吩钠采用薄膜过滤法进行无菌检查，对大肠埃希菌有较强的抑菌活性。结论：头孢噻吩钠无菌检查需加入β-内酰胺酶来消除抑菌活性，以保证其无菌检查的准确性。
【关键词】 头孢噻吩钠 无菌检查 抑菌性 β-内酰胺酶
中国药典规定建立药品的无菌检查法时，应进行方学的验证。本文通过对头孢噻吩钠进行每一株试验菌的验证，证明所采用的方法有效的去除了其抑菌活性，可用于该药品的无菌检查。
头孢噻吩钠为半合成的第一代头孢菌素抗菌，作用机理与青霉素相似，通过抑制细胞壁合成而产生杀菌作用.本品为广谱抗生素。临床主要用于耐青霉素的葡萄球菌和其它敏感菌引起的感染，如呼吸道感染，尿路感染，皮肤软组织感染，败血症，骨髓炎，急性心内膜炎，脑膜炎，梅毒等.
1 材料与仪器
（1）供试品：头孢噻吩钠（批号为：A201106001、A201106002、A201106003）哈药集团制药总厂。
（2）培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营养肉汤培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养琼脂培养基，奥星生物技术有限责任公司。
（3）验证试验用菌种名称及编号：由中检所提供。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B） 26003]；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B） 63501]；大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC（B） 44102]；生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B） 64941]；白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F） 98001]；黑曲霉（Aspergillus niger） [CMCC（F）98003]。
（4）β-内酰胺酶（酶活力不低于240万单位/ml）：张家口市格瑞生物化学科技有限公司。
（5）仪器和滤器：HTY-2000B全封闭集菌仪、全封闭集菌培养器（KSF330型/220型）.杭州高得泰林责任技术有限公司。
2 准备
菌液的制备及菌液计数：
（1）取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基，生孢梭菌新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基，32.5±2.5℃培养18～24小时，取该培养物1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠，分别10倍稀释至约10-510-7之间，混匀备用。
（2）取白色念珠菌新鲜培养物接种至改良马丁琼脂培养基，25.5±2.5℃培养48小时，取该培养物，用0.9%无菌氯化钠10倍稀释至约10-5，混匀备用。
（3）取经23～28℃培养5-7天的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）吐温80的0.9%无菌氯化钠，将孢子洗脱后，用管底部有一圆孔并带有薄的无菌棉花的无菌试管滤出孢子悬液至无菌空试管中，再用上述0.9%无菌氯化钠制成每1ml含菌数小于100cfu孢子悬液，混匀备用。
（4）菌液计数：分别取上述6种菌液1ml分别加入培养皿中，每种菌液做平行2皿，注入相应的琼脂培养基15～20ml。细菌30～35℃培养48小时；真菌23～28℃培养72小时。
判断标准：每1ml菌液中含菌量
试验记录：见表1。
3 操作
（1）供试液制备：取头孢噻吩钠原粉20克，将其溶解并转移至500ml 0.9%氯化钠中，制成约40mg/ml的供试溶液1份，摇匀；依同法制备头孢噻吩钠供试液每批数份，备用。
（2）薄膜过滤：1）取一全封闭集菌培养器（330型），先用少量0.1%蛋白胨溶液润湿，排空，取上述供试液1份按薄膜过滤法平行加入3个滤筒中过滤，每次过滤100ml（即每筒过滤供试液约330ml，含供试品约6.6g）；供试液过滤后，夹住1筒弃掉不用，剩余2筒，每筒分别用0.1%蛋白胨溶液300ml冲洗滤膜，每次各100ml，每次冲洗液过滤前应充分振摇，其中1筒冲洗后不加菌液，注入硫乙醇酸盐流体培养基100ml，作为本次试验的供试品对照，供试品对照应无菌生长；另一筒在过滤最后一次冲洗液时，向冲洗液中加入上述制备好的大肠埃希菌菌液1 ml，过滤后注入硫乙醇酸盐流体培养基100ml，并在每筒培养基中加入β-内酰胺酶约150万单位。同法共做6组，各试验菌及相应培养基逐一进行验证，置规定条件下培养观察。2）对照组：另取一集菌培养器（330型），直接注入硫乙醇酸盐流体培养基100ml，加入上述制备好的大肠埃希菌菌液1ml，作为对照。同法共做6组，各试验菌及相应培养基逐一进行验证，置规定条件下培养观察。3）阴性对照组：另取一集菌培养器（220型），各过滤冲洗用0.1%蛋白胨水溶液300ml后，分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基100 ml，并分别向每筒培养基中注入β-内酰胺酶约150万单位，作为阴性对照。
（3）培养：硫乙醇酸盐流体培养基筒30-35℃培养3天；改良马丁培养基筒23-28℃培养3～5天，每天观察并记录结果。
（4）判断标准：1）对照组培养48～72小时应生长良好。2）与对照组比较，含供试品各容器中的试验菌均生长良好。3）阴性对照组及供试品对照组培养5天，均应无菌生长。
（5）试验记录：见表2。
4 结果讨论
通过试验可得出头孢噻吩钠采用上述方法进行无菌检查，与对照管比较，含供试品各容器中的试验菌均生长良好，说明该品种采用检验量20克，稀释液用量500ml，制成约40mg/ml的供试溶液，用0.1%蛋白胨溶液为冲洗液，每筒冲洗量≥300ml，并在每筒培养基中加入β-内酰胺酶约150万单位的检验条件消除其抑菌性时，其抑菌作用可忽略，此法用于头孢噻吩钠的无菌检查是可行的；同时根据头孢噻吩钠的抗菌谱及中国药典2010年版的相关规定，阳性对照菌选用大肠埃希菌。
参考文献：
[1]中国药典2010年版，第二部.